Niedrig-Eingangs-DNA-Extraktion: Sequenzierung aus minimalen Proben freischalten

Warum die DNA-Extraktion mit geringem Input in der modernen Forschung wichtig ist

In der heutigen Genomiklandschaft ist die Fähigkeit, DNA aus extrem kleinen oder begrenzten Proben zu extrahieren, nicht mehr optional – sie ist unerlässlich. Während die Forschung sich zunehmend auf spezialisierte und präzisionsgetriebene Ziele wie die Modellierung seltener Krankheiten, die Profilierung mikrobieller Gemeinschaften oder die Analyse historischer Proben zubewegt, arbeiten Wissenschaftler oft mit minimalen Mengen biologischen Materials. Ob es sich um eine einzelne Nadelbiopsie, eine laser-erfasste Zellpopulation oder archiviertes Gewebe aus einem jahrzehntealten Paraffinblock handelt, die Herausforderung bleibt dieselbe: Wie extrahiert man verwendbare, hochqualitative DNA aus so wenig Ausgangsmaterial wie möglich?

• Die DNA-Extraktion mit niedrigem Input spricht genau dieses Bedürfnis an. Im Gegensatz zu Standardprotokollen, die Hunderte von Nanogramm oder Mikrogramm Ausgangsmaterial voraussetzen, sind Methoden mit niedrigem Input darauf ausgelegt, DNA aus Mikrogramm bis hin zu sub-Nanogramm-Eingangslevels zu gewinnen – ohne die Integrität zu beeinträchtigen. Diese Fähigkeit ist zunehmend entscheidend in Bereichen wie:
• Translational und personalisierte Forschung, bei der Biopsiematerial kostbar und begrenzt ist.
• Umwelt- und mikrobielle Genomik, wo die Probenbiomasse von Natur aus gering ist.
• Alte DNA und Studien zu degradierten Proben, bei denen die Erhaltung minimal ist

Mit dem Aufstieg von fortschrittlichen Next-Generation-Sequenzierung (NGS)-Plattformen, die eine hohe Reinheit des Ausgangsmaterials verlangen – selbst in geringen Mengen – wächst der Wert der DNA-Extraktion mit niedrigem Input stetig. Der Schlüssel liegt darin, Ertrag, Reinheit und Fragmentlänge auszubalancieren und gleichzeitig Verluste während des Extraktionsprozesses zu minimieren.

Häufige Probenarten mit niedrigem Input und ihre Extraktionsherausforderungen

Die DNA-Extraktion mit geringem Input wird entscheidend, wenn es um biologische Proben geht, die von Natur aus klein, wertvoll oder degradiert sind. Solche Proben treten häufig in der translationale Forschung, der Umweltüberwachung, der Entwicklungsbiologie und in Studien zu Mikroben-Wirt-Interaktionen auf. Während jeder Probenart ein einzigartiger biologischer Wert innewohnt, stellen sie auch erhebliche Herausforderungen für die DNA-Rückgewinnung dar, aufgrund von geringer Biomasse, Fragmentierung oder der Anwesenheit chemischer Inhibitoren.

Vertreter von Niedereingangsprobenarten

• Nadelbiopsien und FeinnadelaspirationenHäufig in der Tierforschung und in translationalen Onkologie-Modellen, liefern diese Proben oft nur begrenztes zelluläres Material und können Blut- oder Proteinverunreinigungen enthalten, die die Extraktion beeinträchtigen.
• Formalin-fixierte, paraffin-eingebettete (FFPE) LockenFFPE-Blöcke werden häufig zur Aufbewahrung von Archivproben verwendet, aber die DNA darin ist oft quervernetzt, fragmentiert und chemisch modifiziert – insbesondere nach langfristiger Lagerung.
• Laser-gestützte Mikrodisktion (LCM) GewebeErmöglicht die präzise Auswahl spezifischer Zellpopulationen aus histologischen Schnitten, jedoch kann die Gesamtzahl der erfassten Zellen in den Hunderten oder niedrigen Tausenden liegen, was zu sub-Nanogramm-DNA-Mengen führt.
• Seltene mikrobielle Isolate oder UmweltabstricheDiese Proben können Bakterienzellen in geringer Menge oder degradierte extrazelluläre DNA enthalten, was durch mitisolierte Inhibitoren wie Huminsäuren zusätzlich kompliziert wird.
• Biopsien von kleinen Tier-/PflanzengewebenFrühstadium-Embryonen, winzige Blattscheiben oder kleine Modellorganismen wie C. elegans kann extrem niedrige DNA-Mengen erzeugen, die spezialisierte Methoden erfordern, um Verluste während der Reinigung zu vermeiden.

Herausforderungen bei der Kernextraktion

• Niedrige DNA-AusbeuteMinimale Biomasseeingaben führen zu Gesamterträgen im Pikogramm- bis Nanogramm-Bereich, die unter die Nachweisgrenze standardmäßiger Quantifizierungsmethoden fallen können.
• ProbenzerfallChemische Fixierung (wie bei FFPE), schlechte Lagerung oder mechanisches Scheren können zu stark fragmentierter DNA führen.
• Ko-purifizierte InhibitorenVerbindungen wie Formaldehyd, Polysaccharide, Phenole und Proteine können die PCR-Amplifikation oder enzymatische Reaktionen, die beim downstream NGS-Bibliotheksaufbau verwendet werden, hemmen.

Diese Herausforderungen erfordern maßgeschneiderte Extraktionsprotokolle, die die DNA-Rückgewinnung maximieren und die Übertragung von Inhibitoren minimieren – selbst wenn das verfügbare Material knapp ist.

Schlüsselfaktoren, die den DNA-Ertrag und die Qualität aus Mikromustern beeinflussen

Bei der Arbeit mit Proben mit niedrigem Input sind eine ausreichende DNA-Ausbeute und die Aufrechterhaltung einer hohen molekularen Integrität entscheidend, aber oft schwierig. Der Erfolg nachgelagerter Anwendungen – insbesondere NGS – hängt davon ab, mehrere miteinander verbundene Faktoren während des Extraktionsprozesses zu verstehen und zu optimieren.

1. Probenlagerung und -konservierung

Die Integrität der DNA beginnt mit der Art und Weise, wie die Probe vor der Extraktion aufbewahrt wird. Frische oder schockgefrorene Proben neigen dazu, längere DNA-Fragmente zu erhalten, während archivierte oder unsachgemäß gelagerte Materialien (z. B. luftgetrocknete, bei Raumtemperatur gelagerte FFPE-Blöcke) oft degradierte DNA liefern.

• Frische/gefrorene ProbenAm besten geeignet für die Erhaltung von hochwertiger, hochmolekularer DNA.
• FFPE oder gealterte ProbenFührt typischerweise zu fragmentierter DNA aufgrund chemischer Vernetzung und langfristiger Zersetzung.

2. Lyse-Methode

Effiziente Zelllyse ist entscheidend, um die DNA-Freisetzung zu maximieren, insbesondere aus robusten oder wenig vorhandenen Materialien. Harte Bedingungen können jedoch auch DNA schädigen.

• Enzymatische Verdauung (z. B. Proteinase K): Bevorzugt für sanfte Lyse in Low-Input-Workflows.
• Hitze- oder alkalische LyseBietet schnelle Ergebnisse, kann jedoch die DNA-Integrität beeinträchtigen, wenn sie nicht ordnungsgemäß gepuffert ist.
• Mechanische Störung (z. B. Perlenmischen): Nicht empfohlen für ultraniedrige Eingaben aufgrund von Scherbelastungen und Probenverlust.

Der Schlüssel liegt im Ausbalancieren einer gründlichen Analyse mit der Erhaltung der Länge der DNA-Fragmente.

3. Reinigungstechnologie

Die Methode zur Reinigung von DNA—insbesondere bei niedrigen Konzentrationen—hat direkten Einfluss auf den Ertrag und die Übertragung von Inhibitoren. Traditionelle Spin-Säulen können bei sub-Nanogramm-Niveaus unter schlechter Rückgewinnung leiden, während Plattformen auf Basis von magnetischen Perlen für die hoch effiziente Auffangung von Spurenmengen optimiert werden können.

• Perlenbasierte Methoden mit Träger-RNA die Wiedergewinnung verbessern und Adsorptionsverluste reduzieren.
• Silica-Säulensets, während sie schnell sind, erfordern sie oft ≥10 ng Eingabe und können unterhalb dieser Schwelle weniger effizient sein.

4. Elutionsvolumen

Eine häufige Herausforderung bei der Mikro-DNA-Extraktion ist die Verdünnung des endgültigen Eluates. Das Eluieren in Standardvolumina (z. B. 100 µL) kann zu DNA-Konzentrationen führen, die für die Bibliotheksvorbereitung oder Quantifizierung zu niedrig sind. Optimierte Protokolle eluieren typischerweise in ≤20 µL, um messbare Konzentrationen sicherzustellen.

Tipp: Verwenden Sie niedrig bindende Röhren und konzentrieren Sie Eluate nach der Extraktion (z. B. mit Vakuumverdampfung) für eine verbesserte Leistung in nachgelagerten Anwendungen.

Zusammen bestimmen diese Faktoren den Kompromiss zwischen Wiederherstellungseffizienz und Fragmentintegrität—eine entscheidende Überlegung bei der Planung von Low-Input-Sequenzierungs-Workflows.

Bewährte Methoden zur DNA-Extraktion mit geringem Input

Die Extraktion von DNA aus mikro-skalierten oder degradierten Proben erfordert Arbeitsabläufe, die Sensitivität mit Reinheit in Einklang bringen. Traditionelle Protokolle scheitern häufig daran, ausreichende DNA zu gewinnen oder führen aufgrund von Probenverlust zu Verzerrungen. Im Folgenden sind mehrere validierte Methoden aufgeführt, die für Szenarien mit niedrigem Input maßgeschneidert sind und für eine Rückgewinnung von Spuren optimiert wurden, ohne die Qualität der nachfolgenden Sequenzierung zu beeinträchtigen.

1. Magnetische Perlenbasierte Reinigung mit Träger-RNA

Magnetische Perlen-basierte Systeme (z. B. AMPure XP oder gleichwertige silikabeschichtete Perlen) ermöglichen hohe Rückgewinnungsraten selbst bei <10 ng Eingangsmenge. Die Verwendung von Träger-RNA verbessert die DNA-Fällung und verhindert Verluste während der Waschschritte.

• Vorteile: Skalierbar, automatisierungsfreundlich, gut für geringe Volumina.
• Nachteile: Erfordert eine genaue Verhältnisregelung; kann Spuren von RNA übertragen, wenn nicht gründlich gereinigt.
• Am besten geeignet für: FFPE-Rollen, laser-mikrodissektierte Gewebe, Nadelbiopsien.

2. Enzymatisch unterstützte Lyse für spurenhafte Zellinputs

Die enzymatische Verdauung mit Proteinase K, Lysozym oder RNase A hilft, Nukleinsäuren schonend freizusetzen und die DNA-Integrität zu bewahren. Dies ist besonders nützlich für zelllimitierte Proben oder wenn die mechanische Homogenisierung zu schonend ist.

• Vorteile: Minimiert DNA-Scherung und bewahrt längere Fragmente.
• Nachteile: Längere Inkubationszeiten; verbleibende Proteine können zusätzliche Reinigung erfordern.
• Am besten geeignet für: Archivierung von Tiergewebeschnitten, kleinen mikrobiellen Kulturen, Kryoschnitten.

Adaptierte von Russo et al. (2022): PFGE – oder ähnliche Fragmentanalysen – die die Rückgewinnung von HMW-DNA aus Pflanzenproben unter Verwendung von enzymunterstützten, niedereingabebasierten Extraktionsprotokollen demonstrieren.

3. Wärme- und alkalische Lyse mit minimaler Reinigung

Dieses Verfahren kombiniert eine schnelle Zelllyse mit Natriumhydroxid und Wärme (~95°C), gefolgt von einer Neutralisation. Obwohl die Fragmentgröße typischerweise kleiner ist, bietet es einen schnellen Weg zur nachgelagerten Amplifikation.

• Vorteile: Schnell, keine spezielle Ausrüstung erforderlich, niedrige Kosten.
• Nachteile: Nicht ideal für Anwendungen, die hochmolekulare DNA benötigen.
• Am besten geeignet für: Screening-Workflows, qPCR oder amplicon-basiertes NGS aus rohen Quellen.

4. Spezialisierte Niedrig-Eingangs-Kits (z. B. DNA-Reinigung- und Konzentrationskits)

Kommerziell erhältliche Kits zur DNA-Rückgewinnung im Sub-Nanogramm-Bereich bieten vereinfachte Arbeitsabläufe. Viele enthalten integrierte Konzentrationsschritte und DNA-bindende Verbesserungen.

• Vorteile: All-in-One-Lösungen; validiert für NGS.
• Nachteile: Könnte pro Reaktion teurer sein; Überprüfen Sie die Plattformkompatibilität.
• Am besten geeignet für: Zeitkritische oder Mehrbenutzer-Kernlaborumgebungen.

Zusammenfassung Vergleichstabelle

DNA-Quantifizierung und Qualitätskontrolle bei niedrigen Eingaben

Eine genaue Quantifizierung und Qualitätskontrolle (QC) sind entscheidend, wenn man mit DNA-Proben mit niedrigem Input arbeitet. Traditionelle Methoden sind oft in Bezug auf Sensitivität und Zuverlässigkeit unzureichend, weshalb eine ordnungsgemäße Validierung unerlässlich ist, bevor mit dem Bau von NGS-Bibliotheken fortgefahren wird.

1. Qubit-Fluorometrische Quantifizierung

• Qubit-Systeme (z. B. dsDNA High Sensitivity) verwenden fluoreszierende Farbstoffe, die spezifisch für doppelsträngige DNA sind, und können Konzentrationen von bis zu 0,01 ng/µL nachweisen – weit unterhalb der Nachweisgrenze von Spektrophotometern.
• Vorteil: Quantifiziert präzise Proben mit niedrigem Input ohne Störungen durch RNA oder freie Nukleotide.
• Beste Praxis: Verwenden Sie Qubit für alle Proben mit niedrigem Ertrag, um eine zuverlässige Quantifizierung für die Bibliotheksvorbereitung sicherzustellen.

Abbildung angepasst von Simbolo et al. (2013) – NanoDrop überschätzt die DNA-Konzentration erheblich in Anwesenheit von RNA, während Qubit genau bleibt.

2. Nanodrop-UV-Spektrophotometrie

• Nanodrop misst die DNA-Reinheit über die UV-Absorption (260/280- und 260/230-Verhältnisse), hat jedoch eine begrenzte Empfindlichkeit und schätzt die Konzentration oft zu hoch ein – bis zu 10 % höher als Qubit bei niedrigen Konzentrationen.
• Ideale Verwendung: Schnelle Überprüfungen der Reinheit in Proben ≥20 ng/µL und zur Identifizierung von Verunreinigungen.
• Einschränkung: Nicht empfohlen für die präzise Quantifizierung von Proben mit niedrigem Input.

3. TapeStation / Fragment Analyzer (Kapillarelektrophorese)

• Automatisierte Elektrophorese-Plattformen wie Agilent TapeStation bieten sowohl die Größenverteilung als auch eine numerische Qualitätsbewertung (DIN) mit nur etwa 1 µL Probe.
• DIN (DNA-Integritätsnummer): Reicht von 1 (degradiert) bis 10 (intakt); ein gängiger QC-Schwellenwert für NGS ist DIN ≥ 7.
• Fragment Analyzer's GQN (Genomic Quality Number): Gibt den Prozentsatz der DNA über einem benutzerdefinierten Größenlimit an – wertvoll für Workflows mit niedrigem Input.

Empfohlener QC-Workflow für Low-Input-DNA

• Qubit gewährleistet genaue Konzentrationsdaten für die Einrichtung von Bibliotheken.
• Nanodrop identifiziert Verunreinigungen, die nachgelagerte Prozesse hemmen können.
• Die Kapillarelektrophorese bietet einen schnellen, aber detaillierten Einblick in die Integrität – entscheidend für den Erfolg bei niedrigem Input.

Tipps zum Umgang zur Minimierung von DNA-Verlust

Der Umgang mit Mikro-DNA erfordert besondere Sorgfalt, um wertvolles Material zu erhalten. Befolgen Sie diese forschungsbasierten Best Practices, um die Ausbeute bei Niedriginput-Extraktionen zu maximieren:

1. Verwenden Sie Kunststoffe mit niedriger Retention und Tipps

DNA kann an Standard-Polymeroberflächen haften, was die Rückgewinnung aus Niedervolumenproben erheblich verringert. Niedrig-bindende Röhrchen und Niedrig-Rückhalte-Spitzen sind so konzipiert, dass sie die Oberflächenadsorption minimieren und die Probe bewahren – Forschungen zeigen, dass die Verluste bei gewöhnlichen Kunststoffen zwischen 10 und 90 % liegen können.

Beste Praxis: Verwenden Sie stets zertifizierte, niedrig-bindende Verbrauchsmaterialien während der Extraktions-, Transfer- und Lagerungsphasen.

2. Vorbenetzen von Pipettenspitzen und sanftes Pipettieren verwenden

Das Vorbenetzen verbessert die Präzision, indem es die Spitzenoberfläche sättigt und verdunstungsbedingte Volumenfehler reduziert. Darüber hinaus verbessert langsames und gleichmäßiges Pipettieren – das Halten der Spitzen in vertikaler Position und eine kurze Pause nach der Aspiration – die Genauigkeit, insbesondere bei Volumina von ≤50 µL.

Technik: Aspirieren und einmal abgeben, um vorzunässen, dann langsam pipettieren und dabei die Wände des Rohres berühren, um verbleibende Tropfen aufzufangen.

3. Minimierung von Transfers und Probenhandhabung

Jeder Übertragungsschritt birgt das Risiko eines Probenverlusts durch Haftung an den Wandungen des Röhrchens oder Verdampfung. Optimieren Sie die Arbeitsabläufe durch:

• Direkte Elution in endgültige Low-Bind-Lagerröhrchen
• Vermeidung mehrerer Überweisungen, wenn möglich
• Schritte konsolidieren, um den Umgang zu reduzieren

4. Arbeiten in klimatisierten, kontaminationsfreien Umgebungen

Temperatur und Luftstrom beeinflussen die Handhabung von Niedervolumen. Führen Sie das Pipettieren in temperaturkontrollierten Räumen durch, vorzugsweise in einem laminarer Strömungshaube oder einer Reinbank. Wechseln Sie regelmäßig die Handschuhe, wischen Sie die Oberflächen ab und verwenden Sie UV-Sterilisation, wenn verfügbar.

Warum es wichtig ist: Der Standard-Luftstrom im Labor kann bei Volumina von <10 µL zu einer erheblichen Verdampfung der Proben führen.

5. Führen Sie bei Bedarf eine Post-Elutionskonzentration durch.

Bei sehr niedrigen Eingaben sollten Sie in Erwägung ziehen, die DNA nach der Elution mit einem Speed-Vakuumkonzentrator oder durch Ethanolfällung (mit Träger-RNA) zu konzentrieren. Dieser Prozess erhöht die DNA-Konzentration und verbessert die Kompatibilität mit der nachfolgenden Bibliotheksvorbereitung.

Zusammenfassung der Handhabungstipps

Die Befolgung dieser Vorsichtsmaßnahmen verringert das Risiko, wertvolle DNA bei Niedriginput-Extraktionen zu verlieren, und unterstützt eine erfolgreiche nachgelagerte Sequenzierung.

Fazit: Sequenzierung aus knappen Materialien ermöglichen

Niedrigaufwändige DNA-Extraktionstechniken eröffnen neue Horizonte in der Genomforschung – sie verwandeln winzige oder degradierte Proben in wertvolle Sequenzierungsdaten. Durch die Kombination optimierter Extraktionsmethoden, präziser Quantifizierung, sorgfältiger Handhabung und kompatibler Bibliotheksvorbereitung können Forscher nun zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus Eingaben erzeugen, die zuvor als unbrauchbar galten.

Betrachten Sie die entscheidende Pipeline für den Erfolg:

• Maßgeschneiderte Extraktionsworkflows (z. B. auf Perlenbasis, enzymunterstützt), die für Szenarien mit niedrigem Input entwickelt wurden
• Genauigkeit bei der Quantifizierung und Qualitätskontrolle (Qubit, TapeStation), die Proben auf Spurenniveau validiert.
• Sorgfältige Probenhandhabung (niedrig-bindende Verbrauchsmaterialien, minimierte Transfers), um jedes Nanogramm zu erhalten.
• Kompatible, niedrig-input Bibliothekskits, die auf minimalen Aufwand und hohe Wiedergabetreue geprüft wurden.

Unsere Sequenzierungsdienste sind speziell darauf ausgelegt, Projekte zu unterstützen, bei denen das Probenmaterial begrenzt ist – sei es bei Nadelbiopsien, LCM-Proben, seltenen mikrobiellen Isolaten oder archiviertem FFPE-Gewebe. Wir bieten vollständig verwaltete Workflows von der Extraktion bis zur Sequenzierung und gewährleisten Reproduzierbarkeit, Sensitivität und Datenqualität.

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Referenzen:

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2. Berezina M.Gambin A., Konopliannikov A. u. a. "Vergleich von DeNovix, NanoDrop und Qubit zur DNA-Quantifizierung und Verunreinigungsdetektion von bakteriellen DNA-Extrakten." PLOS ONE, 17. Juni 2024. DOI: 10.1371/journal.pone.0305650
3. Shaw K. J., Thain L., Docker P. T. u. a. "Der Einsatz von Träger-RNA zur Verbesserung der DNA-Extraktion aus mikrofluidikbasierten Silica-Monolithen." Analytica Chimica Acta, 2009. DOI: 10.1016/j.aca.2009.03.038
4. Alessia Russo u. a. Niedriginput-DNA-Extraktion mit hohem Molekulargewicht für Langzeit-Sequenzierung aus Pflanzen verschiedener Familien. Front Pflanzenwissenschaften. DOI: 10.3389/fpls.2022.883897