Best Practices für die Extraktion von hochmolekularer DNA für Long-Read-Sequenzierung

Warum hochmolekulare DNA für die Langzeit-Sequenzierung wichtig ist

Langzeit-Sequenzierungstechnologien, wie zum Beispiel PacBio und Oxford Nanopore Technologien (ONT) sind stark auf die Integrität und Länge der Eingangs-DNA angewiesen, um qualitativ hochwertige Reads zu liefern. Im Gegensatz zu Short-Read-Plattformen, die DNA-Fragmente von 100–300 Basenpaaren verarbeiten, können Long-Read-Systeme Fragmente verarbeiten, die sich über Zehner- bis Hunderte von Kilobasen (kb) erstrecken – vorausgesetzt, die Eingangs-DNA ist ausreichend intakt.

Hochmolekulare DNA (HMW), typischerweise definiert als Fragmente größer als ~50 kb (und möglicherweise über 100 kb hinausgehend), bietet mehrere entscheidende Vorteile:

• Verbesserte Kontiguität der Genomassemblierung.

In ihrer wegweisenden Studie untersuchten Jain et al. (2018) (DOI: Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von Links nicht abrufen oder übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.) verwendete Nanopore-Sequenzierung mit ultralangen Reads (N50 > 100 kb, bis zu 882 kb), um ein menschliches Referenzgenom (GM12878) mit deutlich verbesserter Kontinuität zusammenzustellen. Die Hinzufügung dieser langen Reads erhöhte die NG50-Metrik von ~3 Mb auf ~6,4 Mb, was eine vollständigere Abdeckung und Lückenauflösung ermöglichte.

Nanopore-Sequenzierung und -Assemblierung eines menschlichen Genoms mit ultra-langen Reads (Jain) u. a.. 2018).

• Verbesserte Erkennung struktureller Varianten.

Längere Reads überbrücken komplexe oder sich wiederholende Regionen und ermöglichen die Erkennung großer Insertionen, Deletionen und Umstellungen, die häufig von fragmentierten Short Reads übersehen werden.

• Hochkonfidenz-Phasierung und epigenetische Erkenntnisse.

Lange zusammenhängende Fragmente unterstützen die Phasierung von Allelen über Kilobasen hinweg und bewahren native DNA-Modifikationen (z. B. Methylierung), die für fortgeschrittene genomische Studien unerlässlich sind.

Im Wesentlichen ist der Erwerb von HMW-DNA nicht optional – es ist die Grundlage für die Erzeugung von ultralangen Reads, die die vollen Möglichkeiten des Langzeit-Sequenzierens erschließen. Techniken, die die DNA-Länge oder -Integrität beeinträchtigen, beschränken intrinsisch die Read-Länge, die Qualität der Assemblierung und die genomischen Einblicke.

Herausforderungen bei der Isolierung von HMW-DNA

Die Gewinnung von HMW-DNA, die für Langzeit-Sequenzierung geeignet ist, ist technisch anspruchsvoll. Mehrere kritische Herausforderungen können die DNA-Integrität beeinträchtigen und die Qualität der nachgelagerten Daten beeinflussen:

Mechanisches Schneiden & DNA-Fragmente

Hohe Scherkräfte durch aggressives Pipettieren, Vortexen oder schnelles Zentrifugieren können lange DNA-Stränge erheblich fragmentieren. Ein umfassendes Protokoll für Chlamydomonas reinhardtii nachgewiesen, dass die Minimierung der physischen Handhabung – insbesondere die Eliminierung von Vortexing und die Verwendung von breiten Pipettenspitzen – dazu beiträgt, die Fragmentgrößen über 50 kb zu erhalten, was durch Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) verifiziert wurde (Frédéric Chaux). u. a.,. 2024).

Frost-Tau-Zyklen

Wiederholte Zyklen von Gefrieren und Auftauen schwächen DNA-Moleküle durch die Bildung von Eiskristallen, was zu Brüchen führt. Die Aufbewahrungsempfehlungen raten dazu, das Gefrieren und Auftauen zu minimieren und die Lagerung bei 4 °C für die kurzfristige Nutzung oder konstant bei −80 °C für die langfristige Lagerung zu bevorzugen.

Kontaminanten aus Lyse und Probenmatrix

Substanzen wie Proteine, Polysaccharide, Phenole oder verbleibende Lyse-Reagenzien können die Sequenzierung hemmen oder zu fragmentierter DNA führen. Pflanzen- und Pilzproben sind besonders anfällig: Protokolle, die CTAB + β-Mercaptoethanol verwenden, haben eine verbesserte Reinheit und hohe Integrität in Proben mit hohem Polysaccharidgehalt gezeigt.Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzt haben möchten.).

Unzureichende Lyse und chemische Schäden

Unvollständige Lyse führt zu niedrigen Ausbeuten, aber aggressive Puffer oder verlängerte Verfahren können DNA schädigen. Zum Beispiel hilft β-Mercaptoethanol, oxidativen Schaden zu reduzieren und DNasen zu hemmen – muss jedoch ausgewogen eingesetzt werden, um zu vermeiden, dass DNA durch übermäßige Reagenzien geschädigt wird.

Standard-Kits nicht für HMW-DNA optimiert

Viele kommerzielle Kits auf Basis von Spin-Säulen oder Beads sind effizient für kleine Fragmente, führen jedoch zu geschertem DNA-Material, das weit unter dem gewünschten Bereich von 50–100 kb liegt. Die technischen Hinweise von Oxford Nanopore und PacBio empfehlen HMW-spezifische Protokolle (z. B. Nanobind), um ultra-lange Fragmente zu erhalten.

Zusammenfassung der Fehlerpunkte und Risiken

Zusammen verdeutlichen diese Faktoren, dass die HMW-DNA-Extraktion nicht routinemäßig ist – sie erfordert optimierte Protokolle, anwendungsspezifische Anpassungen und sorgfältige Handhabung, um die DNA-Integrität für Long-Read-Sequenzierung aufrechtzuerhalten.

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Probenvorbereitung: Die richtige Ausgangsmaterialwahl

Sorgfältige Auswahl und Handhabung des Ausgangsbiomaterials sind entscheidend für eine erfolgreiche HMW-DNA-Extraktion. Im Folgenden sind wichtige Faktoren zu berücksichtigen:

Probenart und -entnahme

Verschiedene Probenarten – wie frisches Gewebe, gefrorene Proben, Zellpellets, Blut sowie mikrobielles oder pflanzliches Material – unterscheiden sich in der Einfachheit der HMW-DNA-Extraktion.

Wirbeltiergewebe (z. B. Muskel, Milz): PacBio empfiehlt entweder frisches Gewebe, das innerhalb von 24 Stunden bei 4 °C verarbeitet wird, oder schnellgefrorene Proben, die bei –80 °C gelagert werden, um die DNA-Integrität zu bewahren.

BlutprobenVollblut mit Antikoagulanzien wie K2-EDTA sollte schnell verarbeitet oder eingefroren werden und innerhalb weniger Tage bei 4 °C verwendet oder bei –80 °C gelagert werden.pacb.com).

Mikrobielle, pflanzliche oder InsektenprobenJede erfordert Protokollanpassungen – PacBio hebt sanfte Homogenisierungsmethoden wie den TissueRuptor für Insekten und das Mahlen mit flüssigem Stickstoff für robuste Pflanzengewebe hervor.pacb.com).

Beste Praxis: Schnellgefrieren oder sofortige Kaltlagerung minimiert die Enzymaktivität und den DNA-Abbau bei allen Probenarten.

Eingangsmenge und -qualität

Die ideale Eingabemenge variiert je nach Probenart und Extraktionsmethode:

Blut, kultivierte Zellen, BakterienzellenDas Nanobind PanDNA-Kit von PacBio funktioniert gut mit 1–5 Millionen Zellen oder 200–400 µL Vollblut und liefert 3–30 µg HMW-DNA mit einer Modusfragmentgröße von über 100 kb.

PflanzengewebeDie Probenvorbereitung mit Nukleusisolierung liefert die besten Ergebnisse. Eingangsvolumina von 0,25–5 g Pflanzenkerne ergeben typischerweise große DNA-Fragmente (>100 kb).

Wichtige Erkenntnis: Eine angemessene Eingabemasse gewährleistet sowohl den Ertrag als auch die DNA-Integrität und unterstützt die nachgelagerte Langlesesequenzierung.

Probenbezogene Anleitung

Protokollauswahl: Bewährte Methoden zur HMW-DNA-Extraktion

Die Auswahl des richtigen Extraktionsprotokolls ist entscheidend für die Erhaltung hochmolekulare (HMW) DNA geeignet für Langlese-Sequenzierung. Hier sind bewährte, forschungsbasierte Methoden, die für die PacBio- und Oxford Nanopore-Plattformen optimiert sind:

1. Nanobind-Magnetplattensets (PacBio)

PacBio empfiehlt Nanobind CBB- und PanDNA-Kits mit Magnetplattentechnologie zur schonenden Isolierung von HMW-DNA aus verschiedenen Probenarten – Blut, Zellen, Gewebe, Pflanzenkerne und Insekten – alles innerhalb von ca. 1–2,5 Stunden und mit Erträgen von Fragmenten von 50–300+ kb.

HauptvorteileMinimale mechanische Belastung durch scheibenbasierte Bindung, Einbeziehung eines Short Read Eliminators (SRE) zur Entfernung kleinerer Fragmente (<10 kb) und Kompatibilität mit sowohl PacBio HiFi- als auch Nanopore-Sequenzierungs-Workflows.

2. Sanfte Lyse mit Zellkernisolierung und CTAB/Pipettierkontrolle

Für Pflanzen- und Insektenproben kann die initiale Isolierung der Zellkerne (z. B. über CTAB-Puffer und Beta-Mercaptoethanol) gefolgt von einer Nanobind-basierten Extraktion ultra-lange DNA erhalten. Eine Fallstudie zu Esche und Eibe Dieses Protokoll wurde verwendet, um Pflanzenkerne effizient zu isolieren und erfolgreich Fragmente von etwa 100 kb sowohl für ONT- als auch für PacBio HiFi-Sequenzierung zu erhalten.

Verwenden Sie breite Spitzen oder Pipettieren zur Mischung; schütteln Sie nur während der frühen Resuspension—keine starke Agitation danach.

3. Phenol-Chloroform-Extraktion mit Agarose-Plug-Einkapselung

Historisch verwendet für mikrobielle Genome und herausfordernde metagenomische Proben, beinhaltet diese Methode das Einbetten von Proben in Agarose-Plugins, das Durchführen einer sanften Lyse, die Phenol-Chloroform-Extraktion und die Agarase-Digestion zur Freisetzung von DNA.

• Vorteile: In der Lage, extrem lange DNA-Fragmente (>200 kb) zu erzeugen.
• Nachteile: Arbeitsintensiv, Risiko von UV-Schäden, Phenoloxidation und unvollständige Entfernung von Verunreinigungen.

4. Kommerzielle Spin-Column-Kits: Nicht empfohlen für HMW-DNA

Konventionelle Spin-Kits (z. B. Silica-Säulen oder magnetische Bead-Kits) führen häufig zu mechanischem Scheren, was zu fragmentierter DNA führt, die für Long-Read-Sequenzierung ungeeignet ist.

5. Best-Practice-Handhabungstechniken

Halten Sie sich bei allen Methoden an diese grundlegenden Praktiken:

Verwenden Sie Pipettenspitzen mit weiter Öffnung. und Vortexbildung vermeiden nach der initialen Lyse zur Reduzierung von Scherkräften.

Verwenden Sie Röhrchen mit geringer Bindung. (z.B. Eppendorf Protein LoBind), um den DNA-Verlust zu reduzieren.

Minimieren Sie Frost-Tau-Zyklenund DNA sanft bei Raumtemperatur über mehrere Stunden wieder in Lösung bringen, um die Löslichkeit zu verbessern.

Überwachung der Nutzung des Extraktionspuffers vor und nach der Lyse, um eine optimale Ausbeute und Integrität zu gewährleisten.

Übersichtstabelle: Verglichene Protokolle

Diese optimierten Methoden stellen sicher, dass Sie erhalten HMW-DNA von ausreichender Länge und Reinheit, die hochwertige Ergebnisse bei Langzeit-Sequenzierungen ermöglichen.

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Untersuchung der FFPE-DNA-Extraktion und deren Einschränkungen

Qualitätskontrolle: Messung der Größe und Integrität extrahierter DNA

Sicherstellen hochmolekulare DNA (HMW-DNA) ist intakt und rein vor der Sequenzierung, was für zuverlässige Langzeitdaten unerlässlich ist. Hier sind die wichtigsten QC-Schritte und Messungen, die in Forschungslabors und Kernanlagen verwendet werden:

Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE)

PFGE bleibt der Goldstandard für die Trennung großer DNA-Fragmente, die von mehreren zehn bis hin zu mehreren hundert Kilobasen reichen. Es kann Fragmente von bis zu ~2 Megabasen auflösen und bietet visuelle Bestätigung der Integrität von HMW-DNA. PFGE ist besonders nützlich zu Beginn der Vorbereitung, um Scherungen zu erkennen und Anpassungen der Extraktionsmethoden zu steuern.

2. Fragmentanalyse (Kapillarelektrophorese)

Systeme wie Agilent TapeStation und Fragmentanalysator Automatisierung der DNA-Größenbestimmung und Reinheitsbewertung.

Der Fragment Analyzer bietet eine Genomic Quality Number (GQN) – den Prozentsatz der DNA über einem festgelegten Schwellenwert – und bietet quantitative Qualitätskontrolle für die HMW-Extraktion.

Diese Werkzeuge werden aufgrund ihrer Geschwindigkeit (15–30 Minuten pro Durchlauf), Multiplex-Fähigkeiten und minimalen Probenanforderungen (~1–5 µL) häufig verwendet.

3. Spektrophotometrie und Fluorometrie (Nanodrop & Qubit)

Nanodrop liefert Reinheitsverhältnisse: OD260/280 (~1,8) und OD260/230 (~2,0–2,2). Diese weisen auf Protein- oder organische Verunreinigungen hin, die die Bibliotheksvorbereitung hemmen oder die Lese-länge reduzieren können.

Qubit-Assays Messen Sie die Konzentration von doppelsträngigem DNA präzise, im Gegensatz zu Nanodrop, das von RNA oder freien Nukleotiden beeinflusst werden kann.

Empfohlene QC-Metriken

Tipp zur Vorbereitung auf Langtexte

Kombinieren Sie qualitative (PFGE) und quantitative (DIN/GQN, Nanodrop/Qubit) Bewertungen, um die DNA-Integrität vollständig zu überprüfen. Eine frühzeitige Erkennung von Fragmentierung ermöglicht Maßnahmen wie eine erneute Extraktion oder Größenauswahl, um den Ertrag von Langlesungen zu erhalten.

Lagerungs- und Handhabungstipps zur Erhaltung der DNA-Integrität

Die richtige Lagerung und Handhabung sind entscheidend für die Aufrechterhaltung hochmolekulares (HMW) DNA Qualität für Langlese-Sequenzierung. Im Folgenden finden Sie evidenzbasierte Best Practices zur Erhaltung der DNA-Fragmentlänge und -reinheit:

1. Minimierung von Frost-Tau-Zyklen

Das wiederholte Einfrieren und Auftauen von DNA-Proben kann aufgrund der Bildung von Eiskristallen und mechanischem Stress hochmolekulare Stränge fragmentieren. Forschungen zur Extraktion von Langstrang-DNA betonen, solche Zyklen zu vermeiden, indem Aliquotierung von Proben, sie konsistent bei –20 oder –80 °C zu lagern und jeweils nur mit einem Aliquot zu arbeiten.

2. Optimale Lagertemperatur

• Kurzfristig (Wochen bis einige Monate): Lagern Sie HMW-DNA bei 4 °C in einer gepufferten Lösung wie 10 mM Tris-HCl (pH 8–9), um die Stabilität ohne Frost-Tau-Schäden zu gewährleisten.
• Langzeitlagerung (mehrere Monate und länger): Verwenden Sie –20 °C oder –80 °C Lagerung und stellen Sie sicher, dass aliquotiert wird, um wiederholte Auftauzyklen zu vermeiden.

3. Sanfte Handhabungspraktiken

• Verwenden Sie immer Pipettenspitzen mit großem Durchmesser und pipettieren Sie langsam und minimal, um mechanische Schäden an DNA-Fragmenten zu reduzieren.
• Vermeiden Sie das Vortexen; mischen Sie die Proben durch sanftes Invertieren oder Schütteln.
• Verwenden Sie Low-Bind- oder Protein LoBind-Röhrchen, um zu verhindern, dass DNA an den Wänden der Röhrchen haftet, insbesondere während einer längeren Lagerung.

4. Verwendung von Puffer und Versandüberlegungen

• Lagern Sie DNA in einer neutralen, gepufferten Lösung (z. B. Tris-HCl-Puffer) anstelle von Wasser, um eine Zersetzung durch pH-Schwankungen zu verhindern.
• Für den Versand oder die langfristige Lagerung wird Trockeneis empfohlen, und die Proben sollten gefroren bleiben, um Agitation und mechanischen Stress zu reduzieren.

Zusammenfassung der Speicherstrategie

Praktischer Tipp für Laborabläufe

Eine Einrichtung schaffen Probenmanagementprotokoll dazu gehört das Beschriften von Aliquots mit Datum/Volumen, das Verfolgen der Freeze-Thaw-Historie und die Verwendung von vorgekühlten Verbrauchsmaterialien, um während des Transfers oder der Vorbereitung konstante Temperaturen aufrechtzuerhalten.

Diese Best Practices stellen sicher, dass Ihre HMW-DNA die Anforderungen erfüllt. Integrität erforderlich für ultra-lange Reads, die Sequenziergenauigkeit und die Qualität der nachgelagerten Assemblierung zu maximieren.

Anwendungs-Spotlight: PacBio vs. Nanopore Plattformanforderungen

Bei der Planung eines Long-Read-Sequenzierungsprojekts ist es wichtig, jede Plattform zu verstehen. DNA-Eingabebedürfnisse und Qualitätsanforderungen ist entscheidend. Im Folgenden finden Sie einen prägnanten Vergleich von PacBio und Oxford Nanopore, der hervorhebt, wie hochmolekulares Gewicht (HMW) DNA unterstützt die optimale Leistung jedes Systems.

PacBio (SMRTbell-Bibliotheksanforderungen)

PacBio's HiFi-Sequenzierungs-Workflow fordert hochqualitatives HMW-DNA:

• DNA-Integrität: Die meisten Fragmente sollten 30–50 kb überschreiten, gemessen mit Femto Pulse oder PFGE.
• Mindestmasse des Eingangs:
• Fortsetzung I: ~150 ng gDNA (>30 kb)
• Sequel II/IIe: ~400 ng gDNA (>30 kb) pro Singleplex-Bibliothek.
• Bibliotheksausbeute: Eine typische Einzelzell- oder Multiplexbibliothek mit ~400–1.000 ng Eingabe kann ausreichend Template für eine SMRT-Zelle 8M erzeugen, die mehr als 10 Gb Daten liefert.
• Whole Genome Amplicons: Für 10 kb Amplicon-Bibliotheken (z. B. Revio-Plattform) ist ein Input von ≥100 ng amplifizierter DNA ausreichend für ≥2 SMRT-Zellen mit SPRQ-Chemie.

Das Protokoll von PacBio betont die Qualitätskontrolle der Fragmentlänge (>30 kb) und eine genaue Eingangsquantifizierung, um einen optimalen Ertrag und hochpräzises Sequenzieren zu gewährleisten.

Oxford Nanopore (Ligation- vs. Rapid-Kits)

Oxford Nanopore bietet flexible Kits, die auf Langleseanwendungen zugeschnitten sind:

• Ligation-Sequenzierungs-Kit:
• ~1 µg HMW gDNA; kann mit 100–500 ng arbeiten.
• Bibliotheksvorbereitungszeit: ~65 Minuten; Fragmentierung ist optional, wenn HMW-DNA verwendet wird.
• Ladestrategie: Bei Bibliotheken über 10 kb verbessert das Laden von 800–1.500 ng die Porenbelegung und den Datenausstoß (~8–10 Gb) auf Hochdurchsatzplattformen.
• Schnelle Sequenzierungs-Kits:
• ~100–400 ng HMW gDNA (>30 kb) für lange und ultra-lange Fragmente.
• Workflow: Transposase-basiert, <10 Minuten Vorbereitung; weniger Pipettenschritte erhalten die Fragmentintegrität.

Die durchschnittlichen und medianen Lese-längen von Nanopore (20–30 kb, manchmal >50 kb) sowie der Ertrag der Bibliothek hängen stark von der ursprünglichen DNA-Qualität und der Minimierung der Handhabung für ultra-lange Fragmente ab.

Tabelle zum Vergleich der Schlüssel

Den richtigen Weg wählen

• Für präzisionsorientierte Projekte (z. B. de novo Assembly, Variantenbestimmung) bietet PacBios HiFi unvergleichliche Genauigkeit – vorausgesetzt, die Eingangs-DNA erfüllt die Integritätsanforderungen.
• Für ultra-lange Reads (z. B. Telomerauflösung, strukturelle Varianten) bieten die Rapid/Ultra-long Kits von Nanopore in Kombination mit einer ultra-sanften Vorbereitung die längsten verfügbaren Reads.
• Die Verfügbarkeit von Proben kann die Wahl des Kits bestimmen: Ligation-Workflows tolerieren geringere Eingaben, während HiFi- und ultra-lange Methoden größere, intakte DNA erfordern.

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Fehlerbehebung: Niedriger Ertrag oder Fragmentierung? So gehen Sie vor.

Selbst mit optimierten Protokollen können Herausforderungen wie niedrige DNA-Ausbeute oder übermäßige Fragmentierung während der HMW-DNA-Extraktion auftreten. Hier ist ein praktischer Leitfaden zur Fehlersuche, um häufige Probleme zu beheben und die Ergebnisse zu verbessern:

1. Niedrige DNA-Ausbeute

Mögliche Ursachen & Lösungen:

• Ineffiziente Lyse / Nuclease-Abbau
• Stellen Sie sicher, dass eine vollständige Zell- oder Gewebelyse erfolgt, indem Sie ausreichend mit Proteinase K oder RNase A inkubieren.
• Eine verlängerte Verdauung kann den Ertrag steigern und die Beeinflussung durch Nukleasen verringern.

Probenverlust während der Reinigung

• Wenn die DNA-Konzentration nach der Extraktion (Qubit) erheblich niedriger ist als die von NanoDrop, könnten verbleibende RNA oder einzelsträngige DNA die NanoDrop-Messwerte erhöhen.
• Behandeln Sie mit RNase und Exonuclease VII, und reinigen Sie dann mit 0,45× AMPure PB-Perlen, um Verunreinigungen zu entfernen (gemäß den Empfehlungen von PacBio).

Niedrige Eingabemenge

Für Proben, die seltene Zellen oder kleine Gewebeproben enthalten, ziehen Sie in Betracht, diese zu bündeln oder Niedrig-Eingabe-Extraktionsprotokolle wie das Nanobind PanDNA-Kit oder spezielle Arbeitsabläufe für Pflanzen/Insekten zu verwenden.

2. DNA-Fragmente oder Scherung

Erkennung & Lösungen:

• Fragmentierung erkennen
• Führen Sie PFGE, TapeStation oder Fragment Analyzer durch, um die Größenverteilung zu bewerten. Ein Schmiereffekt unter dem Zielwert weist auf eine Scherung hin.
• Häufige mechanische Stressquellen
• Vermeiden Sie Vortexen, schnelles Pipettieren oder Zentrifugation bei hohen Geschwindigkeiten. Verwenden Sie breite Spitzen und sanftes Invertieren.
• Enzymatische oder chemische Scherung
• Überverdauung oder aggressive Reagenzien können DNA schädigen. Verwenden Sie Puffer mit Antioxidantien (z. B. Beta-Mercaptoethanol) und begrenzen Sie die Expositionszeit.

3. Kontamination durch RNA, Proteine oder Reagenzien

Identifizierung und Bereinigung:

• Reinheitsmetriken
• A260/280 < 1,8 oder A260/230 < 2,0 weist auf Kontamination hin. Reinigen Sie mit einer bead-basierten Reinigung oder Phenol-Chloroform-Extraktion (mit Vorsicht).
• Protein- oder Reagenzübertragung
• Sichtbare Pellets während der Extraktion deuten auf unvollständige Entfernung hin. Fügen Sie eine zusätzliche Ethanolwäsche hinzu oder verwenden Sie die standardisierten Wäschen von Nanobind.

4. Plattform-spezifische Ertragsprobleme

PacBio SMRT-Sequenzierung

Eine niedrige Polymerase-Lese-Länge oder Gesamtertrag kann auf eine Kontamination der Bibliothek oder Überladung zurückzuführen sein. Überwachen Sie die P0-, P1- und P2-Metriken in SMRT Link und optimieren Sie die DNA-Menge pro SMRT-Zelle.

ONT-Sequenzierung

Suboptimale Porenbelegung und Durchsatz könnten auf zu viele kurze Fragmente hinweisen. Verwenden Sie DNA-Reparaturkits und optional eine sanfte Fragmentierung (z. B. Covaris g-Tubes), um die von ONT vorgeschlagenen N50-Werte zu verbessern.

5. Inhibitoren oder Umweltverschmutzung

Umwelt-DNA-Kontamination

• Proben mit niedrigem Input sind gefährdet, von Hintergrundkontamination betroffen zu sein; immer negative/Kontrollblanks während der Extraktion einbeziehen.

Reagenqualität

• Verwenden Sie nuklease- und DNA-freie zertifizierte Reagenzien. Filtern oder autoklavieren Sie Puffer, um mikrobiologische oder chemische Kontamination zu verhindern.

Fehlerbehebung Referenztabelle

Eine ordnungsgemäße Fehlersuche stellt sicher, dass Ihre HMW-DNA-Präparationen konsequent die Qualitätsstandards erfüllen, die für hochpräzises Langzeit-Sequencing erforderlich sind.

Beziehen Sie sich auf die Fehlersuche bei der FFPE-DNA-Extraktion →

Referenzen:

1. Jain, M., Koren, S., Miga, K. H., Quick, J., Rand, A. C., Sasani, T. A., Tyson, J. R., … Loose, M. (2018). Nanopore-Sequenzierung und -Zusammenstellung eines menschlichen Genoms mit ultralangen Reads. Nature Biotechnology, 36(4), 338–345.
2. Pacific Biosciences (2024). Anleitung und Übersicht – Nanobind PanDNA-Kit. Abgerufen aus der PacBio-Dokumentation.
3. Pacific Biosciences (2024). Anleitung und Übersicht – Nanobind CBB-Kit. Abgerufen aus der PacBio-Dokumentation.
4. Protocols.io (2019). Pulsfeld-Gelelektrophorese für Langzeit-Sequenzierung [Protokoll].
5. PacBio Blog (2025). Tipps zur DNA-Extraktion und bewährte Praktiken für HiFi-Sequenzierung.
6. Bellott, D., Ting-Jan, C., Ting-Jan, C., Skaletsky, H., Hughes, J., & Page, D. (2022). SHIMS 3.0: Hochgradig effiziente iterative Kartierung und Sequenzierung von Einzelhaplotypen mit ultra-langen Nanoporen-Lesungen. PLoS One, 17(6), e0269692.
7. Tipps und bewährte Methoden zur DNA-Extraktion für HiFi-Sequenzierung - PacBio. Es tut mir leid, aber ich kann den Inhalt von Webseiten nicht direkt übersetzen. Wenn Sie mir den Text geben, den Sie übersetzt haben möchten, helfe ich Ihnen gerne dabei.