DNA-Extraktion aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem (FFPE) Gewebe

DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe mit dem Genom-DNA-Isolationskit

Legen Sie zwei bis fünf 10 μm Schnitte von FFPE-Gewebe (von ungefähr 1 cm)² in Größe) in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
Fügen Sie 1000 μl Xylol hinzu und vortexieren Sie gründlich für 10 Sekunden (arbeiten Sie in einer Schutzkabine).
3. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 20.000 × g.
4. Entfernen Sie die Überstände vorsichtig und geben Sie sie in spezielle Abfallbehälter.
Fügen Sie 1000 μl 99% Ethanol hinzu.
Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 20.000 × g.
7. Entfernen Sie vorsichtig das Ethanol.
Fügen Sie erneut 1000 μl 99% Ethanol hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen umdrehen.
9. Zentrifugieren Sie 5 Minuten bei 20.000 × g.
10. Entfernen Sie allen Ethanol und lassen Sie das verbleibende Gewebe an der Luft trocknen, indem Sie das Röhrchen offen lassen, und inkubieren Sie es 10–15 Minuten bei 37 °C in einem Thermoblock.
11. Resuspendieren Sie das Pellet in 180 μl Puffer ATL.
Fügen Sie 20 μl Proteinase K hinzu und mischen Sie durch Vortexen.
13. Über Nacht bei 56 °C inkubieren.
14. Inkubieren Sie bei 90 °C für 1 Stunde.
Fügen Sie 200 μl Puffer AL zur Probe hinzu und mischen Sie gründlich durch Vortexen.
Fügen Sie 200 μl Ethanol (96–100%) hinzu und mischen Sie erneut gründlich durch Vortexen.
17. Fahren Sie mit der Extraktion und DNA-Reinigung fort, bevor Sie mit den Probenvorbereitungen zur Beurteilung der Klonalität beginnen.

DNA-Extraktion aus FFPE-Gewebe mit der Chelex-Methode

1. Deparaffinierte 0 μm Gewebeschnitte bis Schritt 10.
Fügen Sie 200 μl von 5% Chelex-100, homogen gemischt in TET-Lysepuffer, hinzu.
3. Inkubieren Sie 5 Minuten bei 95 °C in einem Thermoshaker bei 350 U/min.
4. 5 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
5. Fügen Sie 20 μl Proteinase K hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 56 °C in einem Thermoshaker bei 350 U/min.
6. Inkubieren Sie 10 Minuten bei 95 °C in einem Thermoshaker bei 350 U/min.
7. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 20.000 × g bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 20.000 × g bei Raumtemperatur.
10. Übertragen Sie den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
11. Fügen Sie 180 μl ATL-Puffer (QIAamp DNA Micro Kit) hinzu, vortexen Sie 10 s und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.
12. Inkubieren Sie bei 80 °C für 10 Minuten und lassen Sie dann auf Raumtemperatur abkühlen.
13. Zentrifugieren Sie das 1,5 ml Röhrchen kurz, um Tropfen von der Innenseite des Deckels zu entfernen.
14. Fügen Sie 200 μl Puffer AL hinzu und vortexen Sie kurz.
15. Inkubieren Sie bei 70 °C für 10 Minuten und lassen Sie dann auf Raumtemperatur abkühlen.
16. Fügen Sie 250 μl 96% Ethanol hinzu und vortexen Sie kurz.
17. Fahren Sie mit dem Verfahren zur DNA-Reinigung fort, bevor Sie mit den Probenvorbereitungen zur Beurteilung der Klonalität beginnen.

DNA-Reinigung mit QIAamp DNA-Mikrosäule

Übertragen Sie vorsichtig das gesamte Lysat in die QIAamp MinElute-Säule (in einem 2 ml Auffangröhrchen) und zentrifugieren Sie es bei 6000 × g für 1 Minute.
2. Platzieren Sie die QIAamp MinElute-Säule in ein sauberes 2 ml Sammlungsglas und entsorgen Sie das Sammlungsglas mit dem Durchfluss.
3. Fügen Sie 500 μl Puffer AW1 auf die Säule hinzu und zentrifugieren Sie bei 6000 × g für 1 Minute.
4. Entsorgen Sie den Durchfluss und fügen Sie 500 μl Puffer AW2 zur Säule hinzu.
Zentrifugieren Sie bei 6000 × g für 1 Minute und entsorgen Sie die Durchlaufflüssigkeit.
6. Zentrifugieren Sie bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g) für 3 Minuten, um die Membran vollständig zu trocknen.
7. Platzieren Sie die QIAamp MinElute-Säule in einem sauberen 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen und entsorgen Sie das Auffangröhrchen mit dem Durchfluss.
8. Tragen Sie 20–100 μl Puffer ATE (QIAamp DNA FFPE Kit) oder 20–100 μl Puffer AE (QIAamp DNA Micro Kit) in die Mitte der Säulmembran auf.
9. Bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubieren.
10. Zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei voller Geschwindigkeit (20.000 × g).
11. Entsorgen Sie die Säule und behalten Sie das 1,5 ml Röhrchen mit der DNA-Lösung.
12. Bestimmen Sie die DNA-Konzentration und verdünnen Sie sie gegebenenfalls auf eine Arbeitslösung von 20–40 ng/μl mit dem verwendeten Elutionspuffer oder MQ.

Referenz:

1. van Bladel D A G, van der Last-Kempkes J L M, Scheijen B, et al. Klonalitätsnachweis von Immunoglobulin-Genumstellungen bei B-Zell-Lymphomen basierend auf Next-Generation-Sequencing[M]//Immunogenetik. Humana, New York, NY, 2022: 7-42.