Bibliothekskonstruktion für Next-Generation Sequencing (NGS)

Next-Generation-Sequenzierung (NGS), auch bekannt als Hochdurchsatz-Sequenzierung, hat sich aus PCR- und Gen-Mikroarray-Technologien entwickelt. Diese innovative Sequenzierungsmethode führt reversible Terminierungsenden ein, die es ermöglichen, dass die Sequenzierung gleichzeitig mit der Synthese erfolgt. Die Bestimmung von DNA-Sequenzen erfolgt durch das Erfassen neu hinzugefügter Basen mit spezifischen Markern während des DNA-Replikationsprozesses. In einem bedeutenden Durchbruch stellte Roche 2005 den ersten Next-Generation-Sequenzer, den Roche 454, vor, was den Beginn der Ära der Hochdurchsatz-Sequenzierung markierte. Und Illumina wird zur beliebtesten Sequenzierungsplattform.

Diese Sequenzierungstechnologie hat eine herausragende Bedeutung in der Lebenswissenschaft und der pharmazeutischen Forschung, da sie in der Lage ist, schnell umfangreiche Daten mit einer relativ kurzen Leselänge zu generieren. Im NGS-Workflow besteht der erste Schritt darin, die Proben-DNA zu konstruieren, gefolgt von maschinellen Tests und anschließender Analyse. Der Aufbau der Sequenzierungsbibliothek ist eine entscheidende Phase, die den Erfolg von NGS Forschung. Die Qualität von DNA und Produkten zur Bibliothekskonstruktion beeinflusst erheblich Parameter wie die Umwandlungsrate der Bibliothek, Sequenzierungstiefe, Komplexität und Homogenität. Daher sind strenge Qualitätskontrollmaßnahmen während des gesamten Sequenzierungsprozesses unerlässlich.

Was ist die Bibliothekskonstruktion in der NGS?

Eine DNA-Bibliothek umfasst eine Reihe von Vorbereitungsschritten für DNA/RNA-Proben vor der Sequenzierung. Die ursprünglichen Nukleinsäureproben können nicht direkt für die Sequenzierung verwendet werden; nur verarbeitete Proben können die Anforderungen der Sequenzierungsplattform erfüllen. Diese Vorbereitungen beinhalten Aufgaben wie das Einführen notwendiger Endverbindungen zu DNA-Proben, eine Voraussetzung für die Sequenzierung. Bei unzureichendem Probenvolumen wird die PCR-Amplifikation eingesetzt, um die Kriterien der Maschine zu erfüllen. Der Aufbau der DNA-Bibliothek bildet die Grundlage von Next-Generation-Sequenzierung Bibliothekstechnologie.

Qualitätskontrolle im NGS-Bibliotheksvorbereitungsworkflow könnte ein hilfreicher Artikel für die Sequenzierung und Analyse sein.

Stellt die Schritte dar, die an der Next Generation Sequencing beteiligt sind: Bibliotheksvorbereitung und Amplifikation, Sequenzierung und Datenanalyse sind die drei wichtigen Schritte, die an NGS beteiligt sind. (Selvakumar et al., 2022)

Die Konstruktion von DNA-Bibliotheken liegt im Zentrum von Next-Generation-Sequenzierung Bibliothekstechnologie. Sie umfasst den entscheidenden Schritt, Endverbindungen zu den zu untersuchenden Fragmenten hinzuzufügen. Es gibt verschiedene Methoden zur Konstruktion von DNA-Bibliotheken, die basierend auf ihren Ansätzen zur Bildung von Verbindungen kategorisiert werden:

• TA-Klonierungs-Junction-Konstruktion
• Swift-Methode
• Transposase-Bibliothekskonstruktion
• PCR-Ampliconkonstruktion
• Bau einer Flachendverbindungsbibliothek

Methoden der NGS-Bibliotheksvorbereitung

TA-Klonierungs-Junction-Bibliothekskonstruktion

Die Konstruktion von TA-Klonierungs-Junction-Bibliotheken ist derzeit die am weitesten verbreitete Methode zur Bibliothekskonstruktion. Der Prozess umfasst die folgenden Schritte:

• Genomische DNA-Fragmentierung.
• Endreparatur der fragmentierten DNA und Hinzufügung eines A-Schwanzes.
• Befestigung des Adapters.
• Probenkonzentrationsverstärkung durch PCR-Amplifikation.

Diese Technik erfordert die vorherige Synthese von Zielfragmenten mit T-schwänzigen Adaptern und A-schwänzigen Enden, die anschließend über TA-Klonierung, unterstützt durch DNA-Ligase, mit fragmentierten Proben verbunden werden.

Swift-Methode

Die Konstruktionsmethode der Swift-Bibliothek weist Ähnlichkeiten mit der Konstruktionsmethode der TA-Klonierungs-Junction-Bibliothek auf. Sie beinhaltet die Einführung von P5- und P7-Junction-Sequenzen an beiden Enden des zu untersuchenden Fragments. Nach der Endreparatur wird die P7-Junction zunächst am 3'-Ende verbunden, gefolgt von der Verbindung der P5-Junction am 5'-Ende. Anschließend wird die Probenkonzentration durch PCR-Amplifikation erhöht.

Transposase-Bibliothekskonstruktion

Der Grundstein für den Bau von Transposase-Bibliotheken liegt im Tn5-Transposon, einem DNA-Fragmente, das das Transposase-Gen kodiert. Der traditionelle Bibliotheksbau umfasst die Fragmentierung von DNA, die Endreparatur, die Amplifikation der Bibliothek und die mehrstufige Reinigung. Die Nutzung von Tn5 für den Bibliotheksbau vereinfacht jedoch den Prozess und fasst mehrere Schritte in einer einzigen Reaktion zusammen.

Der in vitro Transponierbare Elemente des Tn5-Transposons, die für den Bibliotheksaufbau verwendet werden, umfassen die terminale Sequenz des Transposons, die Ziel-DNA, Transposase (Tnp) und Mg2+ (Aktivator).

PCR-Amplikon-Bibliothekskonstruktion

Die Methode zur Konstruktion der Amplicon-Bibliothek verwendet eine PCR-Reaktion, um an den Enden der Zielfragmente Verknüpfungen einzuführen, was nur zwei Runden von PCR und Reinigung erfordert, um die gewünschte Bibliothek zu erzeugen. Zunächst werden Primer, die die universelle Sequenz enthalten, mit dem Zielbereich kombiniert. Anschließend werden die Sequenzierungsverknüpfungen im zweiten Schritt durch eine PCR-Reaktion verbunden.

Flach-End-Junction-Bibliothekskonstruktion

Die Methode der flach-endigen ligierten Adapter umfasst das Anbringen spezifischer Adapter an die Enden fragmentierter DNA-Fragmente. Dieser Ansatz folgt einer Reihe von Schritten, einschließlich der Fragmentierung von DNA-Proben, der Endreparatur, der Adapterligatur, der selektiven Rückgewinnung von DNA-Fragmenten, der PCR-Anreicherung der Bibliothek und der Reinigung des PCR-Produkts. Der Sequenzierungsprozess zur Konstruktion von Bibliotheken mit flach-endigen ligierten Adaptern beinhaltet vorübergehende pH-Abnahmen im Mikroumfeld, die von einer pH-Elektrode erfasst und aufgezeichnet werden, um die Datenlesungen zu erleichtern.

Illumina DNA-Bibliothekskonstruktion

Bitte lesen Sie unseren Artikel: Illumina Next-Generation Sequencing (NGS): Prinzipien und Arbeitsablauf für weitere Informationen.

Fragmentierung

Die initiale Phase des Bibliotheksbaus umfasst die Überwindung der Lese-Längen-Beschränkungen von Sequenziermaschinen. Die extrahierte DNA kann aufgrund dieser Einschränkungen nicht direkt sequenziert werden. Daher werden verschiedene Methoden, wie ultrasonische Fragmentierung und enzymatische Verdauung, eingesetzt, um die DNA präzise in Fragmente geeigneter Längen zu schneiden. Während mechanische Methoden höhere Probenverluste und Komplexität mit sich bringen können, werden enzymatische Methoden, insbesondere solche, die die Tn5-Transposase nutzen, aufgrund ihrer Kosteneffizienz und Einfachheit bevorzugt. Der Tn5-Transposon, der ursprünglich in E. coli identifiziert wurde, besteht aus wichtigen Komponenten, einschließlich IS50-Sequenzen, Outside End (OE)-Sequenzen, Inside End (IE)-Sequenzen und Genen für Arzneimittelresistenz.

Endreparatur/Ergänzung des A-Schwanzes

Nach der Fragmentierung können die DNA-Enden flache oder unebene Eigenschaften aufweisen. In diesem Schritt werden die Enden der DNA-Fragmente modifiziert, und eine charakteristische A-Base wird hinzugefügt, um ein klebriges Ende für die anschließende Anheftung des Junction-Primer zu schaffen.

DNA-Fragmente, die im vorherigen Schritt erzeugt wurden und 5'/3' klebrige Enden oder flache Enden aufweisen, unterziehen sich einer Endreparatur, um alle klebrigen Enden in flache Enden umzuwandeln. Für das TA-Joining sind die Phosphorylierung am 5'-Ende und die Hinzufügung eines "A" am 3'-Ende entscheidend für die komplementäre Paarung mit Verbindungsstellen, die "T" klebrige Enden besitzen. Dieser Prozess umfasst das gemeinsame Wirken von T4-DNA-Polymerase, T4-Polynukleotid-Kinase und Taq-DNA-Polymerase.

DNA-Bibliotheksvorbereitung mittels einer transposase-basierten Methode (Nextera), entwickelt von Illumina. (Head et al., 2014)

• T4-DNA-Polymerase zeigt eine 5'→3' DNA-Polymeraseaktivität, indem sie DNA in Richtung 5'→3' synthetisiert und 5' überstehende Enden begradigt. Darüber hinaus begradigt ihre 3'→5' Exonukleaseaktivität 3' überstehende Enden und verwandelt DNA-Fragmente mit klebrigen Enden in DNA mit glatten Enden.
• T4 Polynukleotidkinase ist entscheidend für die Katalyse der Übertragung der γ-Phosphatgruppe von ATP auf die Hydroxylgruppe am 5'-Ende des Oligonukleotidstrangs und bereitet die Verbindungen für den anschließenden Verbindungsprozess vor.
• Taq-DNA-Polymerase zeigt eine 5'→3' Polymeraseaktivität, um DNA in Richtung 5'→3' zu synthetisieren, und eine Desoxynukleotidtransferaseaktivität, um ein Nukleotid "A" an das 3'-Ende des PCR-Produkts anzufügen. Diese komplexen Prozesse gewährleisten die Vorbereitung von DNA-Fragmenten mit optimierten Enden für die nachfolgenden Schritte der Illumina-DNA-Bibliothekskonstruktion.

Kreuzungen

DNA-Fragmente mit angehängten A-Schwänzen weisen ausgeprägte A-Termini auf, die ihre komplementäre Paarung mit Verzweigungen ermöglichen, die T-Termini tragen. Das Hauptziel der Einbeziehung von Verzweigungen besteht darin, Bibliotheks-Tags und Oligonukleotidsequenzen, die mit der Sequenzierungsplattform komplementär sind, an die Enden der fragmentierten DNA anzuhängen.

Junktionen spielen eine entscheidende Rolle in der Bibliothek, wobei Y-Typ Junktionen der Illumina-Plattform häufig in der Sequenzierung verwendet werden. Diese Junktionen umfassen P5/P7, Index und Rd1/Rd2 SP Sequenzen. P5/P7 Sequenzen paaren sich mit den Sequenzen auf dem Sequenzierungschip, um die Fragmente für Tests auf der Flowcell zu verankern und die Brückenamplifikation abzuschließen. Der Index unterscheidet zwischen verschiedenen Proben in der gemischten Bibliothek der Onboard-Sequenzierung, und Rd1/Rd2 SP dient als Primer-Bindungsregion für die Sequenzierung von Read1 und Read2. Die Junktion-Ligation erfolgt typischerweise mit T4 DNA-Ligase, die einzelsträngige Schnitte in doppelsträngiger DNA repariert und benachbarte Nukleotide wieder verbindet. Bei der Junktion-Ligation können Junktionen mit "T" klebrigen Enden und "A" klebrigen Enden nahtlos kombiniert werden, um einen vollständigen Doppelstrang zu bilden.

PCR-Amplifikation

Aufgrund der zuvor hinzugefügten Verzweigung wird eine direkte Amplifikation unter Verwendung von Primern erreicht, die komplementär zur Verzweigung sind. Die nicht komplementären Enden der zuvor hinzugefügten "Y"-Verzweigungen erfordern einen Zwischenschritt vor der direkten Sequenzierung. Um mehrere Proben gleichzeitig zu sequenzieren, können Indizes/Barcodes hinzugefügt werden, um zwischen verschiedenen Proben zu unterscheiden. Dieser Schritt hilft nicht nur dabei, verschiedene Bibliotheken während der nachfolgenden Probenanalyse zu unterscheiden, sondern führt auch Oligonukleotidsequenzen ein, die an beiden Enden durch PCR komplementär zum Sequenzierer sind, speziell P5/P7.

4 Meilensteine in der DNA-Sequenzierungstechnologie

Erster Durchbruch: Direkte Ablesung

• Vor-Direktlesung: Die ursprüngliche Sequenzierungsmethode, die der Direktlesung vorausging, umfasste Techniken wie molekulare Klonierung, PAGE und radiografische Autoradiographie.
• SBC-Methode: Eine chemische Abbaureaktion, die spezifische Reagenzien verwendet, um DNA-Moleküle direkt abzubauen. Gilbert erhielt 1980 den Nobelpreis für Chemie für die Erfindung der SBC-Methode.
• SBS-Methode: Basierend auf enzymatischen Synthesereaktionen und der DNA-Synthese, auch bekannt als die Sanger-Methode oder doppelte Desoxyribonukleinsäure-Terminalterminierungsmethode. Diese Methode bietet Vorteile wie ungiftige Reagenzien, einfache Handhabung, stabile Ergebnisse, hohe Genauigkeit und ausgezeichnete Reproduzierbarkeit.

Z Durchbruch: Automatisierung

• Pioniere der automatisierten Sequenzierung: Akiyoshi Wada, Wilhelm Ansorge.
• Der entscheidende Durchbruch bei der Automatisierung der SBS-Methode kam mit der Erfindung des automatisierten vierfarbigen fluoreszenzmarkierten SBS-Sequenziergeräts von Leroy Hood. Diese Innovation spielte eine entscheidende Rolle bei der Unterstützung und dem Start des Human Genome Project (HGP).

Dritter Durchbruch: Skalierung

• Das Aufkommen und die Verbesserung der Kapillarelektrophorese-Sequenzierungstechnologie erleichterten die Skalierung.
• 1998 führte ABI den ABIPrism 3700 Kapillarsequenzer (ABI3700) ein, der eine direkte Skalierung der Sequenzierungstechnologie ermöglichte. Die anschließende Einführung der MegaBACE-Serie von Sequenzern trug erheblich zum frühen Abschluss des HGP bei.

V Durchbruch: Massiv parallele Sequenzierung

Dies stellt einen erheblichen Fortschritt dar, der durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, DNA in massiv paralleler Weise zu sequenzieren, was zu einer schnellen und gleichzeitigen Analyse mehrerer Fragmente führt. Ein zentrales Merkmal des Sequenzierens ist sein wesentlicher Beitrag zum drastischen Rückgang der Sequenzierungskosten.

Häufig gestellte Fragen: Erstellen einer Sequenzierungsbibliothek

1. Was sind die Hauptschritte bei der Konstruktion einer DNA-Bibliothek?

Die Hauptbestandteile des Aufbaus einer DNA-Bibliothek umfassen:

• Fragmentierung und Endreparatur: Zerlegung der DNA in handhabbare Fragmente und Reparatur der Enden, um eine ordnungsgemäße Ligation zu gewährleisten.
• Ligation: Verbindung der reparierten DNA-Fragmente mit Adaptern oder Vektoren für die Sequenzierung.
• PCR (Polymerase-Kettenreaktion): Amplifikation der ligierten DNA zur Erhöhung der Menge für die Sequenzierung.

Hinweis: Die Schritte zur Reinigung der Perlen sind hier weggelassen.

Zusätzlich erfordert der Aufbau einer Bibliothek aus RNA-Proben einen zusätzlichen Schritt aufgrund der Natur von RNA. Es ist erforderlich, RNA in komplementäre DNA (cDNA) umzukonvertieren, bevor mit dem oben beschriebenen Bibliothekskonstruktionsprozess fortgefahren wird. Das grundlegende Prinzip bleibt jedoch dasselbe.

2. Warum ist es notwendig, gDNA-Proben vor der NGS-Bibliotheksvorbereitung zu fragmentieren?

Illumina-Sequenzierer lesen typischerweise Fragmente im Bereich von 50-600 Basenpaaren, obwohl dieser Bereich je nach verwendeten Sequenzierchips und Reagenzien variieren kann. Im Gegensatz dazu überschreiten die meisten intakten menschlichen genomischen DNA (gDNA)-Proben eine Länge von 10 Kilobasen (kb). Daher ist es entscheidend, diese großen Fragmente in kleinere Stücke zu zerlegen, um eine erfolgreiche Bibliothekskonstruktion zu gewährleisten. Diese Voraussetzung der Fragmentierung gilt auch für die MGI-Plattform.

Tabelle 1 Empfohlene Lese-Längen für verschiedene Anwendungen auf Illumina-Sequenzierungsplattformen

3. Warum ist es entscheidend, nach der DNA-Fragmentierung einen Adapter einzufügen? Welche Bedeutung hat dies?

Ein vollständiger Adapter besteht aus drei Komponenten: universellen Primern (P5&P7), Indizes (i7/i5) und Sequenzierungsprimern (SP1&SP2).

• Universelle Primer die Cluster-Generierung erleichtern, während die Sequenzierungsprimer für die Sequenzierung des Inserts unerlässlich sind.
• Die Splicing-Sequenz wird durch die Sequenzierungsplattform bestimmt.
• Indizierung dient dazu, verschiedene Proben innerhalb desselben Sequenzierungsdatensatzes zu unterscheiden. Bei der Sequenzierung mehrerer Proben auf demselben Chip (≥2) ist das Indizieren entscheidend für die Probenunterscheidung. Wenn jedoch nur eine Probe eine Flusszelle belegt, wird das Indizieren überflüssig, obwohl universelle Primer (P5&P7) und Sequenzierungsprimer (SP1&SP2) weiterhin unerlässlich bleiben.

Hinweis: Obwohl es mehrere Methoden gibt, um eine vollständige Junction zu einer Probe hinzuzufügen, bleibt die Junction-Sequenz der resultierenden Bibliothek konsistent. Wir beabsichtigen, in Zukunft einen Artikel zu widmen, um die unterschiedlichen Strukturen und Verbindungen von Junctions zu erläutern.

4. Warum existieren PCR- und PCR-freie Bibliotheken, und welche ist verbreiteter?

PCR dient als Methode zur Erhöhung des Probenvolumens. Wenn das anfängliche Eingangsvolumen unzureichend ist, ist eine PCR-Replikation notwendig, um das erforderliche Bibliotheksvolumen für die Sequenzierung zu erreichen. Umgekehrt ermöglicht ein ausreichendes Ausgangsvolumen den Abschluss der Junction-Ligation, Reinigung und anschließende Sequenzierung ohne PCR-Amplifikation.

PCR-Bibliotheken sind jedoch aus mehreren Gründen verbreiteter:

• Unzureichendes Startvolumen: Die meisten Proben haben nicht das erforderliche Anfangsvolumen für eine direkte Einarbeitung.
• Spezialisierte physische Struktur: Bibliotheken, die nicht durch PCR amplifiziert wurden, weisen eine einzigartige Y-förmige Verzweigung auf, die Verzerrungen bei der Qualitätskontrolle von Bibliotheken einführen kann.
• Restliche Verbindungen: Das hohe Verhältnis von Verbindungen zu Vorlagen und unzureichende Reinigung führen zu erheblichen restlichen Verbindungen, was die Gesamtqualität der Bibliothek mindert.

5. Warum stellen verschiedene Kits unterschiedliche Anforderungen an die Ausgangsvolumina der Proben?

Die Ausgangsvolumenfähigkeit eines Kits hängt hauptsächlich von der Sensitivität, Spezifität und Stabilität seiner jeweiligen Enzyme ab. Kits, die auf niedrigere Ausgangsvolumen ausgerichtet sind (z. B. nasopharyngeale Abstrichproben für COVID-19-Tests), erfordern eine erhöhte Enzymwirksamkeit, was sich folglich in höheren Preisen niederschlägt. Darüber hinaus verfügen Kits, die für Proben mit niedrigem Ausgangsvolumen entwickelt wurden, häufig über proprietäre Patente und besondere Vorteile, die ebenfalls zu ihren höheren Kosten beitragen. Kontaktieren Sie unser technisches Team. für weitere Informationen.

Referenzen:

1. Selvakumar, Sushmaa Chandralekha et al. "CRISPR/Cas9 und Next-Generation-Sequencing in der personalisierten Behandlung von Krebs." Molekulare Krebsforschung 21.1 (2022): 83.
2. Head, Steven R., et al. "Bibliothekskonstruktion für Next-Generation-Sequencing: Überblicke und Herausforderungen." Biotechniken 56.2 (2014): 61-77.