Qualitätskontrolle im NGS-Bibliotheksvorbereitungsworkflow

der Bibliotheksvorbereitung. Die Implementierung von QC-Maßnahmen vor und nach verschiedenen Phasen des Prozesses gewährleistet qualitativ hochwertige Proben, minimiert kostspielige Fehler und verbessert den Gesamterfolg der Bibliotheksvorbereitung. NGS Experimente.

Next-Generation-Sequenzierung. (Hess et al., 2020)

Die Bedeutung der Probenqualität in der NGS-Bibliotheksvorbereitung

Die Vorbereitung von NGS-Bibliotheken umfasst mehrere kritische Schritte, einschließlich der Fragmentierung von Proben, der Ligation von Sequenzierungsadaptern und der Amplifikation der Bibliothek. Die Qualität der Ausgangsproben hat einen erheblichen Einfluss auf den Erfolg dieser Schritte und damit auf die Sequenzierungsergebnisse. Proben von schlechter Qualität oder unzureichender Konzentration können zu verzerrten oder unzuverlässigen Daten führen, was wertvolle Ressourcen verschwenden und die Forschungsergebnisse verzögern kann. Durch die Durchführung von Qualitätskontrollen während des gesamten Prozesses können Forscher potenzielle Probleme frühzeitig identifizieren und ihre Protokolle für optimale Ergebnisse optimieren.

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Eingangsmaterial QC in der NGS-Bibliotheksvorbereitung

Der Erfolg von NGS hängt stark von der Qualität der Ausgangsmaterialien ab, die im Bibliotheksvorbereitungsprozess verwendet werden. Eine angemessene Qualitätskontrolle (QC) der Ausgangsmaterialien, sei es DNA oder RNA, ist der erste und entscheidende Schritt zur Vorbereitung hochwertiger Bibliotheken und zur Erzielung erfolgreicher Sequenzierungsergebnisse.

Das Ausgangsmaterial, wie genomische DNA oder gesamte RNA, dient als Grundlage für den Bau von NGS-Bibliotheken. Es ist entscheidend, die Qualität und Quantität dieser Proben zu bewerten, bevor mit der Bibliotheksvorbereitung begonnen wird. Hochwertige Ausgangsmaterialien haben einen erheblichen Einfluss auf die nachgelagerten Prozesse und gewährleisten genaue und repräsentative Sequenzierungsdaten. Im Gegensatz dazu können degradierte oder minderwertige Proben zu verzerrten Ergebnissen, Verlust wertvollen Sequenzierungsmaterials und beeinträchtigter Bibliothekskomplexität führen.

Kritische QC-Parameter für Ausgangsmaterial:

• Menge: Eine genaue Quantifizierung des Ausgangsmaterials ist entscheidend, um die geeignete Menge für die Bibliotheksvorbereitung zu bestimmen. NGS-Bibliotheksvorbereitungskits empfehlen häufig spezifische Ausgangskonzentrationen und -mengen, um die Sequenzierungsergebnisse zu optimieren. Eine präzise Quantifizierung stellt sicher, dass die Bibliothek nicht unter- oder übersequenziert wird, was zu optimaler Abdeckung und Datengenerierung führt.
• Reinheit: Die Reinheit des Ausgangsmaterials wird durch die Messung der Absorptionsverhältnisse bei spezifischen Wellenlängen bewertet, typischerweise A260/A280 und A260/A230. Ein A260/A280-Verhältnis nahe 1,8 und ein A260/A230-Verhältnis von etwa 2,0 weisen auf minimale Kontamination durch Proteine, organische Verbindungen oder Salze hin. Kontaminanten können enzymatische Reaktionen während der Bibliotheksvorbereitung stören und möglicherweise die nachgelagerte Analyse beeinträchtigen.
• Integrität: Die Integrität der Nukleinsäureprobe ist entscheidend für eine erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung. Bei RNA-Proben kann die RNA-Integritätszahl (RIN) oder die RNA-Qualitätszahl (RQN) mit Techniken wie der Kapillarelektrophorese bestimmt werden. Hohe RIN/RQN-Werte weisen auf intakte RNA-Moleküle hin, während degradierte RNA zu fragmentierter und verzerrter Bibliothekskonstruktion führen kann.

Reproduzierbarkeit: Sicherzustellen, dass das Ausgangsmaterial reproduzierbar ist, ist entscheidend, insbesondere in Studien mit mehreren Proben. Replikate derselben Probe sollten konsistente QC-Werte liefern, um technische Variabilität während der Bibliotheksvorbereitung zu minimieren.

QC-Prüfpunkte in der NGS-Bibliotheksvorbereitung

Um genaue und zuverlässige Sequenzierungsdaten zu gewährleisten, ist es entscheidend, Qualitätskontroll (QC)-Kontrollpunkte in verschiedenen Phasen des NGS-Bibliotheksvorbereitungsprozesses zu implementieren. Dieser Artikel beschreibt die Bedeutung von QC an verschiedenen Stellen im Workflow, um die Erstellung von hochwertigen Bibliotheken für eine erfolgreiche Sequenzierung zu garantieren.

QC-Prüfpunkte in der NGS-Bibliotheksvorbereitung:

• Muster-QC

Der erste QC-Schritt besteht darin, die Qualität und Quantität der Ausgangsnukleinsäureproben (DNA oder RNA) vor der Bibliotheksvorbereitung zu bewerten. Eine genaue Quantifizierung, Reinheitsbewertung und Integritätsprüfung der Proben sind entscheidend, um Verzerrungen zu vermeiden und eine optimale Repräsentation des ursprünglichen Materials in der Bibliothek sicherzustellen.

• Fragmentierung QC

Nach der Quantifizierung werden die Proben fragmentiert, wodurch sie in kleinere DNA- oder RNA-Fragmente zerlegt werden. Die Qualitätskontrolle in diesem Stadium bestätigt, dass der Fragmentierungsprozess erfolgreich war und dass die Fragmentgrößenverteilung im gewünschten Bereich für das spezifische Experiment liegt.

• Splice-Ligation-Qualitätskontrolle

Nach der Fragmentierung werden die Sequenzierungsadapter an die fragmentierte DNA oder RNA ligiert. Qualitätskontrollen werden durchgeführt, um die Effizienz des Ligationprozesses zu validieren und sicherzustellen, dass die Adapter erfolgreich integriert werden, um eine ordnungsgemäße Anbindung an die Sequenzierungsplattform zu ermöglichen.

• Verstärkungs-QC

Die PCR-Amplifikation ist ein entscheidender Schritt, um die Bibliothek mit sequenzierungsbereitem Material anzureichern. QC-Prüfungen in diesem Stadium bestätigen, dass die Amplifikation erfolgreich war, ohne Über- oder Unteramplifikation, die Verzerrungen einführen und die Komplexität der Bibliothek beeinflussen kann.

• Adapter-Dimer-Erkennung

Während des gesamten Prozesses der Bibliotheksvorbereitung ist es entscheidend, die Anwesenheit von Adapter-Dimeren zu überwachen und zu erkennen. Diese Artefakte können entstehen, wenn überschüssige Adapter miteinander ligieren, was die Repräsentation des ursprünglichen Materials in der Bibliothek verringert. QC-Kontrollen werden durchgeführt, um den Gehalt an Adapter-Dimeren zu minimieren und eine hochwertige Bibliothek sicherzustellen.

• Bibliotheks-Pooling-QC

In Multi-Sample-Studien werden Bibliotheken häufig für multiplexes Sequencing zusammengelegt. Die Qualitätskontrolle beim Pooling umfasst die Quantifizierung und Normalisierung der Konzentration einzelner Bibliotheken, um eine gleichmäßige Repräsentation jeder Probe sicherzustellen und die Sequenzierungseffizienz sowie den Datenausstoß zu maximieren.

QC für die endgültige NGS-Bibliothek

Der letzte Schritt im Prozess der NGS-Bibliotheksvorbereitung ist die PCR-Amplifikation, ein kritischer Schritt, der ausreichende Kopien der Bibliothek für die anschließende Sequenzierung erzeugt. In dieser Phase wird die Ligation von Sequenzierungsadaptern an die fragmentierte DNA oder RNA bestätigt, und die PCR-Amplifikation wird eingesetzt, um die Ziel-DNA-Fragmente anzureichern. Die Qualitätskontrolle (QC) der finalen NGS-Bibliothek ist entscheidend, um den Erfolg des Sequenzierungslaufs sicherzustellen, potenzielle Probleme zu identifizieren und zuverlässige sowie hochwertige Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Bedeutung der Qualitätskontrolle für die endgültige NGS-Bibliothek:

Die endgültige NGS-Bibliothek repräsentiert die DNA- oder RNA-Fragmente, die bereit für die Sequenzierung sind. Die Beurteilung der Qualität der Bibliothek in diesem Stadium ist entscheidend, da sie den Erfolg des nachfolgenden Sequenzierungslaufs bestimmt. Die Qualitätskontrolle der endgültigen Bibliothek hilft dabei:

• Überprüfen Sie die erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung: Bestätigen Sie, dass die Ligation der Sequenzierungsadapter und andere Schritte der Bibliotheksvorbereitung erfolgreich waren, um sicherzustellen, dass die Bibliothek für die Sequenzierung geeignet ist.
• Adapter-Dimer erkennen: Identifizieren Sie das Vorhandensein von überschüssigen Primern oder Adapter-Dimern, die den Sequenzierungsprozess stören und zu einer falschen Darstellung der ursprünglichen Probe führen können.
• Bewerten Sie die Amplifikationseffizienz: Bestimmen Sie, ob die Bibliothek ausreichend amplifiziert wurde. Eine Überamplifikation kann zu erhöhten Duplikaten und Verzerrungen führen, während eine Unteramplifikation zu unzureichender Repräsentation und verringertem Sequenzierungsertrag führen kann.
• Optimierung der Bibliotheks-Pooling: Quantifizieren Sie die Konzentration und molare Konzentration der Bibliothek, um das ordnungsgemäße Pooling mehrerer Bibliotheken für die multiplexe Sequenzierung zu erleichtern und eine gleichmäßige Vertretung jeder Probe sicherzustellen.

QC-Methoden für die endgültige NGS-Bibliothek:

• Elektrophorese: Automatisierte Elektrophorese-Plattformen, wie Bioanalyzer oder TapeStation, werden häufig zur Analyse der Fragmentgröße der finalen Bibliothek verwendet. Das Vorhandensein eines sauberen Bibliotheksdispersion-Peaks bestätigt eine erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung, während das Vorhandensein zusätzlicher Peaks auf die Anwesenheit von Adapter-Dimeren oder anderen Verunreinigungen hinweist.
• Quantifizierung: Fluorometrische Methoden wie Qubit oder qPCR können die Konzentration und molare Konzentration der Bibliothek genau quantifizieren, was eine präzise Zusammenstellung von Bibliotheken für das Sequenzieren ermöglicht.

Bibliothekskomplexitätsanalyse: Techniken wie molekulare Barcodes oder andere Indexierungsstrategien können eingesetzt werden, um die Komplexität der Bibliothek zu bewerten und PCR-Duplikate zu erkennen, die entscheidend sind, um potenzielle Verzerrungen, die während der PCR-Amplifikation eingeführt werden, zu erkennen und zu korrigieren.

Referenz:

1. Hess, Jacob Friedrich, et al. "Bibliotheksvorbereitung für Next-Generation-Sequenzierung: Eine Übersicht über Automatisierungsstrategien." Biotechnologische Fortschritte 41 (2020): 107537.