Warum unterstützt die Variantenerkennung nur Menschen und nicht andere Arten, und was sind die Einschränkungen?

Die Variantenerkennung durch PacBio HiFi-Sequenzierung unterstützt alle Arten. Der Grund, warum die aktuellen Ergebnisse hauptsächlich menschlich sind, liegt hauptsächlich daran, dass das aktuelle menschliche Referenzgenom derzeit das genaueste ist.

Ist der Vorteil von PacBio im Vergleich zu Nanopore in HiFi-Reads?

Der Hauptvorteil der PacBio SMRT-Sequenzierung besteht darin, dass es keine systematischen Fehler gibt, weshalb HiFi-Reads so genau sind.

Was ist die minimale Sequenzierungstiefe, die für eine Standard-HiFi-Assemblierung erforderlich ist? Wie viel Sequenzierungstiefe wäre besser?

Im Allgemeinen hängt es davon ab, wie viele Ploidien das spezifisch assemblierte Genom hat. Nehmen wir das menschliche Genom als Beispiel, empfehlen wir eine Mindesttiefe von 15X-20X. Wenn das Genom mehr als einen Haplotyp hat, muss die Datenmenge auf 10X HiFi erhöht werden. Es hängt jedoch auch von der Komplexität des Genoms ab; wenn es sich um ein komplexes Genom handelt, sind möglicherweise zusätzlich 20X HiFi-Daten für einen weiteren Haplotyp erforderlich.

Der Bau von Bibliotheken mit ultra-niedrigem Startvolumen erfordert Genome unter 500M. Können wir auch andere Arten neben Arthropoden wie Insekten machen?

Wir haben vorerst nur Insekten und Arthropoden getestet, da der DNA-Gehalt einzelner Individuen dieser Proben sehr gering ist. Mikroorganismen haben wir bisher nicht getestet. Um klarzustellen, das Genom ist weniger als 500M, dies gilt für De Novo-Anwendungen; bei der Neusequenzierung gibt es keine Größenbeschränkung des Genoms.

HiFi-Daten sind genauer, können Sie die Genomgröße schätzen?

Tatsächlich können alle durch k-mer geschätzt werden.

Die Genomgröße der Sandfliegen, die von GenomeScope geschätzt wird, beträgt 306 Mb, und die erhaltene Assemblierung beträgt 370 Mb. Wird sie von GenomeScope unterschätzt oder von der Assemblierung überschätzt?

Dies hängt hauptsächlich mit der genomischen Heterozygotie zusammen. Bei der Assemblierung, wenn der Unterschied zwischen zwei Haplotypen groß ist, wird sich dieser Unterschied im Assemblierungsergebnis widerspiegeln und es wird größer erscheinen.

Was ist der Prozess und das Enzym der PCR für den Bau von Bibliotheken mit ultra-niedrigem Startvolumen?

Wir verwenden Long Range PCR. PacBio hat viele Tests durchgeführt, um die beiden PCR-Enzyme auszuwählen, die die genomischen Regionen mit hohem und niedrigem GC-Gehalt so gut wie möglich abdecken können. Nach der Unterbrechung der Probe teilen wir die Probe in zwei Teile, einen für PCR A und den anderen für PCR B. Das Gerät kann die gleichmäßigste genomische Abdeckung erzielen.

PacBio SMRT-Sequenzierung Fragen und Antworten

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