Die Herausforderungen und der Workflow der kleinen RNA-Sequenzierung

Was ist die Sequenzierung von kleinen RNAs?

Kleine RNA-Sequenzierung (Kleine RNA-Seq), unterstützt von Next-Generation Sequencing (NGS) Technologie ist eine instrumentelle Technik zur Isolation und Akquisition von Informationen über nicht-kodierende RNA-Moleküle. Diese Methode ermöglicht die Unterscheidung und Bewertung von kleinen RNAs, einschließlich der Entdeckung neuer Varianten und der Vorhersage ihrer potenziellen Funktionen. Durch die Nutzung solcher Technologien können kleine RNAs von größeren RNA-Familien unterschieden werden, was unser Verständnis ihrer Rollen in zellulären Funktionen und der Genexpression verbessert.

Kleine RNA-Sequenzierung stellt einen zunehmend beliebten Ansatz dar, um die biologischen Probleme von miRNAs und anderen kleinen nicht-kodierenden RNAs (sncRNAs), wie piwi-interagierenden RNAs (piRNAs), kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) und Transkriptionsinitiierungs-RNAs (tiRNAs), anzugehen. MiRNAs, piRNAs und siRNAs sind die drei am meisten fokussierten sncRNAs und werden aufgrund ihrer berichteten wichtigen Rolle in der posttranslationalen Regulation der Genexpression umfassend durch Sequenzierung untersucht. Die Sequenzierung kleiner RNAs hat sich zu einem guten Standard sowohl für die Entdeckung kleiner RNAs als auch für das Profiling kleiner RNAs entwickelt, da sie das gesamte Komplement kleiner RNAs mit hoher Durchsatzrate und hoher Sensitivität sequenzieren können. Im Vergleich zu Mikroarrays und qPCR, kleine RNA-Sequenzierung erfordert kein a priori Wissen über die Sequenz. Neben dem Erwerb des vollständigen Spektrums von miRNA- und kleinen RNA-Spezies, kleine RNA-Sequenzierung hilft auch zu verstehen, wie posttranskriptionale Regulation den Phänotyp beeinflusst und neuartige Identifikationen ermöglicht. BiomarkerEs wurde umfassend in der Krebs- und komplexen Krankheitsforschung angewendet.

Kleine RNAs umfassen eine große Kategorie von regulatorischen Molekülen, einschließlich miRNA, ncRNA, siRNA, snoRNA, piRNA und rasiRNA, die in allen biologischen Entitäten weit verbreitet sind. Diese kleinen RNAs regulieren das Wachstum, die Entwicklung und den Krankheitsverlauf von Organismen durch verschiedene Mittel wie mRNA-Abbau, translationale Repression, Heterochromatinbildung und DNA-Elimination. Die Sequenzierung kleiner RNAs (sRNA), die in der Regel auf der Illumina HiSeq-Plattform durchgeführt wird, ermöglicht eine umfassende Analyse von miRNAs, siRNAs und piRNAs in Proben. Darüber hinaus kann diese Technologie bekannte sRNAs identifizieren, neuartige vorhersagen und sRNA-Zielgene antizipieren, wodurch sie ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung der Funktionalität und regulatorischen Mechanismen kleiner RNAs darstellt.

Abbildung 1. Die Struktur und Klassifikation von kleinen RNAs. (Xiong et al., 2023)

Vorteile der kleinen RNA-Sequenzierung

Kleine RNA-Sequenzierung ist eine Hochdurchsatztechnik, die eingesetzt wird, um nicht-kodierende RNAs wie Mikro-RNAs (miRNA), siRNA und piRNA sowie andere zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die direkte Erzeugung von miRNA-Sequenzierung Bibliotheken aus totaler RNA, wodurch die Rolle von nicht-kodierenden RNAs beleuchtet wird. Durch diesen Ansatz können wir nicht nur verstehen, wie die post-transkriptionale Regulation Phänotypen beeinflusst, sondern auch neuartige biologische Marker identifizieren und ein umfassendes Spektrum an kleinen RNA- und miRNA-Spezies erfassen.

Hochdurchsatznatur: Ein Sequenzierungslauf kann über 5 Millionen Sequenzlesungen erzeugen.

Hohe Empfindlichkeit: Die Hochdurchsatz-Sequenzierung von kleinen RNAs weist eine von Natur aus hohe Empfindlichkeit auf, die es ermöglicht, seltene nicht-kodierende RNA-Moleküle nachzuweisen. Dieses Merkmal ermöglicht es Forschern, nicht-kodierende RNAs mit niedriger Häufigkeit, wie z.B. Mikro-RNAs, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Umfänglichkeit: Diese Methodik ermöglicht die Detektion und Identifizierung aller Arten von kleinen RNA-Molekülen, die in einer Probe vorhanden sind, einschließlich Mikro-RNAs, siRNAs und piRNAs, unter anderem. Dieses Maß an Vollständigkeit ermöglicht es Forschern, die Ausdruckslandschaft der nicht-kodierenden RNAs umfassend zu betrachten.

Hohe Auflösung: Kleine RNA-Sequenzierung ermöglicht die Erkennung kleiner Variationen in kleinen RNAs auf der Ebene einzelner Basen; Präzision: Hochgradig genaue Quantifizierung von wenigen bis zu mehreren Millionen Kopien. Inklusive ihrer Länge und strukturellen Eigenschaften ermöglicht diese hohe Auflösung den Forschern, in die Funktion und die regulatorischen Mechanismen von nicht-codierender RNA einzutauchen.

Keine Abhängigkeit von bekannten Informationen: Es kann bekannte kleine RNAs identifizieren und gleichzeitig neue entdecken.

Exzellente Reproduzierbarkeit: Die tiefgehende Sequenzierung gewährleistet die Zufälligkeit der Proben und bietet eine hervorragende Reproduzierbarkeit, ohne dass Wiederholungsexperimente erforderlich sind.

Datenvielfalt: Die reiche Vielfalt der erzeugten Daten von kleine RNA-Sequenzierung bietet eine Fülle von Informationen, die für die biologische Forschung von Vorteil sind. Die Analyse von Sequierungsdaten ermöglicht das Verständnis von Expressionsmustern nicht-kodierender RNAs, ihren regulatorischen Netzwerken und damit verbundenen krankheitsbezogenen Veränderungen.

Kosten-Effizienz: Mit dem Fortschritt der Sequenzierungstechnologie sinken die damit verbundenen Kosten. kleine RNA-Sequenzierung weiterhin sinken, wodurch es finanziell für eine zunehmende Anzahl von Laboren und Forschungsprojekten zugänglich wird. Diese Kostenreduktion senkt nicht nur die Hürden für die Forschung, sondern fördert auch die breite Anwendung von Studien zu nicht-kodierenden RNAs.

Die Herausforderungen der kleinen RNA-Sequenzierung

Forscher haben allmählich festgestellt, dass die Sequenzierungsdaten, die die differentielle Expression kleiner RNAs enthalten, manchmal inkonsistent mit den Ergebnissen von Mikroarray, qPCR und Northern Blot sind. Dies wurde hauptsächlich auf die RNA-Ligase-abhängige Verzerrung für bestimmte Adaptersequenzen zurückgeführt, die während der Konstruktion der kleinen RNA-Bibliothek eingeführt wurden. Studien haben nahegelegt, dass die Randomisierung der Adaptersequenzen in der Nähe der Ligationstelle die Ligationverzerrung verringern und die Sequenzierungsergebnisse optimieren kann. Das NEXTflex Small RNA-seq Kit von Bioo Scientific ist derzeit das einzige kommerziell verfügbare Kit, das die mit der Ligation verbundenen Verzerrungen reduziert. Dieses Kit verwendet Adapter mit 4 nt zufälligen Enden, die eine gleichmäßigere Abdeckung einzelner kleiner RNA-Spezies bieten. Eine Arbeit von Baran-Gale et al. (2015) hat nahegelegt, dass das NEXTflex-Protokoll das am wenigsten verzerrte Kit ist für kleine RNA-Sequenzierung.

Tabelle 1. Die kommerziell erhältlichen Kits zur Konstruktion von kleinen RNA-Bibliotheken.

Die primären Quellen von Verzerrungen in kleine RNA-Sequenzierung einschließlich Ligation Bias und PCR-Bias. Ligation Bias resultiert aus den Unterschieden in der Sekundärstruktur von miRNA und Adaptern während der Ligation, was dazu führt, dass bestimmte miRNAs eine höhere Ligationseffizienz aufweisen als andere. Dies wirkt sich wiederum auf die Genauigkeit der Daten aus. Mehrere Strategien zur Minderung dieses Problems umfassen die Verbesserung des Adapterdesigns zur Reduzierung von Bias, die Verwendung von computergestützten Korrekturen zur Anpassung der Expressionswerte, den Einsatz spezifischer Enzyme zur Entfernung bestimmter Modifikationen und die Erhöhung der Zufälligkeit der Adapter.

Ein weiterer Bias ist der PCR-Bias, der durch die unterschiedlichen Amplifikationseffizienzen von Molekülen verschiedener Längen und sekundärer Strukturen während des PCR-Prozesses verursacht wird. Um diesen Bias zu verringern, könnten molekulare Barcodes verwendet werden, um PCR-Produkte zu kennzeichnen und somit identische Moleküle zu unterscheiden, die über PCR amplifiziert wurden. Der letzte Schritt in der kleine RNA-Sequenzierung Der Workflow ist die Sequenzierung. Dieser Schritt kann mit bestimmten Arten von Verzerrungen (wie Lane-Effekten und Pooling-Effekten) verbunden sein, aber diese Verzerrungen werden im Allgemeinen als sekundäre Verzerrungen betrachtet, die das Gesamtniveau der Verzerrung subtil beeinflussen.

Derzeit gibt es hauptsächlich drei Methoden, um verschiedene Bias-Probleme anzugehen: (1) ursprüngliche Ligation mit zwei Adaptern; (2) verbesserte Ligation mit zwei Adaptern; (3) ligationsfreie (auf Adenylierung basierende) Methoden. Darüber hinaus gibt es eine Reihe alternativer Technologien, die auf der Hybridisierung von miRNA- und Zielsonden basieren und die Schritte der Ligation oder Polyadenylierung vollständig vermeiden. In bestimmten Fällen wird auch die PCR-Phase und die NGS-Lesungen eliminiert. Diese Techniken bieten in der Regel einen vereinfachten Workflow, der für routinemäßige und automatisierte Analysen geeignet ist. Ihr analysierbares miRNA-Spektrum, das durch eine Reihe vordesignter Sonden bestimmt wird, ist jedoch begrenzt, was ihr Entdeckungspotenzial einschränkt.

(1) Die ursprünglichen zwei Adapter-Ligation-Methoden

Die traditionelle Methode der Dual-Adapter-Ligation besteht darin, zunächst einen vor-adenylierten 3'-Adapter zu verbinden, gefolgt vom 5'-Adapter (Abb. 2). Dieser Ansatz wird aufgrund seiner Anwendbarkeit auf ein breites Spektrum von kleinen RNA-Typen, seiner Fähigkeit, RNAs mit bestimmten Modifikationen zu detektieren, und seiner langjährigen historischen Verwendung bevorzugt. Es gibt jedoch inhärente Einschränkungen. Der Bias bei der Adapterligierung kann dazu führen, dass bestimmte miRNAs überschätzt oder unterschätzt werden oder möglicherweise ganz unentdeckt bleiben. Die Bildung von Adapter-Dimeren kann die Lesezahlen beeinträchtigen und somit die Datenpräzision weiter beeinflussen. Darüber hinaus ist diese Methode nicht in der Lage, spezifische Typen von kleinen RNAs, wie snRNAs mit 3'-Endmodifikationen, zu erfassen.

Abbildung 2. Ursprüngliches Zwei-Adapter-Ligation-Protokoll für die Analyse von kleinen RNA-Sequenzen. (Benesova et al., 2021)

(2) Die verbesserte Methode basierend auf der Ligation von zwei Adaptern

Verbesserte Methoden zur Ligation mit dualen Adaptern zielen darauf ab, Ligation- und PCR-Bias zu mildern oder entgegenzuwirken. Derzeit sind drei Techniken verfügbar: (i) die Kopplung beider Adapter mit zufälligen Nukleotiden (Abbildung 3A); (ii) die Ligation eines einzelnen Adapters gefolgt von der Zirkularisierung (Abbildung 3B); und (iii) die Integration von molekularen Barcodes mit einem dualen Adapter. Zufällige Adapter reduzieren den Ligation-Bias durch die Einbeziehung zufälliger Abschnitte, was eine sorgfältige Handhabung erfordern kann, um die Auswirkungen des PCR-Bias zu vermeiden. Der Ansatz der Ligation mit einem einzelnen Adapter und anschließender Zirkularisierung nutzt die intramolekulare Zirkularisierung, um den Ligation-Bias zu verringern, obwohl es dennoch potenzielle Bias am 3'-Ende geben kann. Im Gegensatz dazu mildert die Methode mit molekularen Barcodes den PCR-Bias durch die Einbeziehung molekularer Barcodes.

Abbildung 3. Verbesserte Methoden zur Ligation mit zwei Adaptern für die Analyse von kleinen RNA-Sequenzen. Die Reduzierung von Ligation- oder PCR-Bias wird erreicht durch: (A) randomisierte Adapter; (B) Ligation mit einem einzelnen Adapter und Zirkularisierung; und (C) molekulare Barcodes. (Benesova et al., 2021)

(3) Ligationsfreies Verfahren

Die ligationsfreien Ansätze umfassen hauptsächlich Verfahren, die auf Polyadenylierung und Template-Switching basieren (Abb. 4), sowie probebasierte Technologien, die alle eine gezielte Analyse bekannter miRNAs ermöglichen. Diese Techniken bieten einen optimierten Arbeitsablauf und eine computergestützte Analyse, während sie die Verzerrungen umgehen, die mit Verknüpfungs- und PCR-Schritten verbunden sind. Der Ansatz, der auf Polyadenylierung und Template-Switching beruht, nutzt die Template-Switching-Aktivität der reversen Transkriptase (RTase), um 5'-Endadapter hinzuzufügen, im Gegensatz zu traditionellen Ligationstechniken. Die Unabhängigkeit dieser Methode von der Ligation ermöglicht eine genauere Quantifizierung von miRNAs und umgeht Verzerrungen, die durch Ligationsschritte eingeführt werden. Sie hat jedoch auch bestimmte Nachteile, darunter, dass einige Reads nicht mit miRNA-Sequenzen übereinstimmen, was zu niedrigeren miRNA-Kartierungsraten und potenziellen Erhöhungen der Sequenzierungskosten führen kann.

Probe-basierte Technologien verwenden spezifische Sonden für die gezielte Analyse bekannter miRNAs. Beispielsweise nutzt der Nanostring nCounter direkte molekulare Barcodes und farbcodierte Sonden für die digitale Erkennung von miRNAs, was ihn für die Quantifizierung von über 800 verschiedenen miRNAs geeignet macht. Der FirePlex miRNA-Test kombiniert Hydrogel-Nanopartikeltechnologie mit miRNA-spezifischen Regionen und universellen Adaptern, wodurch die Quantifizierung von 65 miRNA-Spezies in einer einzigen Reaktion ermöglicht wird und Abweichungen, die durch den Trennungsprozess entstehen, eliminiert werden. In der Zwischenzeit verwendet EdgeSeq Sonden, die spezifisch für die miRNA-Analyse und -Sequenzierung binden. Der Prozess der Bibliotheksvorbereitung ist automatisiert und die computergestützte Analyse standardisiert, was vergleichbare und zuverlässige Ergebnisse liefert.

Abbildung 4. Polyadenylierung und Templatewechselmechanismus, der in der Analyse von kleinen RNA-Sequenzen angewendet wird. (Benesova et al., 2021)

Der Workflow der kleinen RNA-Sequenzierung

Der Arbeitsablauf von kleine RNA-Sequenzierung umfasst in der Regel die totale RNA-Isolation, den Bau von kleinen RNA-Bibliotheken, Deep-Sequencing und bioinformatische Analysen.

Abbildung 5. Weg der kleinen RNA-Sequenzierungstechnologie.

Anreicherung von kleinen RNAs

Angesichts der charakteristisch kurzen Längen von kleinen RNAs, die typischerweise zwischen 20 und 30 Nukleotiden (nt) liegen, ist eine Anreicherung der extrahierten Gesamt-RNA erforderlich. Dieser Prozess kann entweder durch die Verwendung eines speziellen Reagenzkit zur Anreicherung kleiner RNAs, wie dem miRNeasy Mini Kit, oder durch größenselektive Gelelektrophorese durchgeführt werden. Die für die Anreicherung verwendeten Proben können von Zellmaterialien, Geweben bis hin zu verschiedenen Körperflüssigkeiten reichen.

Konstruktion von kleinen RNA-Bibliotheken

Die 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxylgruppen auf der kleinen RNA ermöglichen es Ligasen, diese kleinen RNA-Spezies gezielt zu erfassen und zu fangen. Für kleine RNA-Sequenzierungdie Hochdurchsatz-Sequenzierung von kleinen RNA-Bibliotheken. Die Bibliothekskonstruktion beginnt typischerweise mit der Ligation eines prä-adenylierten DNA-Adapterns an das 3'-Ende der sRNAs unter Verwendung einer verkürzten Version von T4 RNA-Ligase 2, gefolgt von der Ligation eines RNA-Adapters an ihr 5'-Ende mit T4 RNA-Ligase 1. Nach dieser Ligation können die Produkte leicht in cDNA umgeschrieben und durch PCR amplifiziert werden, bevor sie sequenziert werden. Es gibt viele kommerziell erhältliche Kits, die kleine RNA-Bibliotheken direkt aus Gesamt-RNA-Proben erzeugen (Tabelle 1). Die Produkte sind für die Illumina-Sequenzierung geeignet. Die allgemeinen Prinzipien der Konstruktion kleiner RNA-Bibliotheken sind in Abbildung 6 skizziert, aber verschiedene Kits können unterschiedliche Protokolle aufweisen. Der Prozess der Gelreinigung dient der Qualitätskontrolle und der Größenauswahl. Je nach Ihren Forschungsinteressen wird die geeignete Sequenzgröße durch bead-basierte Größenwahl oder PAGE-Reinigung für die Tiefensequenzierung zurückgewonnen. Eine 18-40 bp Insert cDNA-Bibliothek ist eine typische Wahl, die miRNA, siRNA und piRNA abdeckt. Bitte beachten Sie, dass die Sequenzierung von miRNA und mRNA zwei separate Bibliotheksprotokolle erfordert, selbst bei derselben Gesamt-RNA-Probe. Nach der Qualitätskontrolle der kleinen RNA-Bibliotheken wird dann die Hochdurchsatz-Sequenzierung durchgeführt. kleine RNA-Sequenzierungwie MiSeq und HiSeq.

Abbildung 6. Die Prinzipien der Konstruktion von kleinen RNA-Bibliotheken.

Bioinformatikanalyse

Kleine RNA-Sequenzierung kann für die Clusterbildung von kleinen RNAs, die Entdeckung neuer kleiner RNAs, die Vorhersage von miRNA-Zielen, die differenzielle Expression von kleinen RNAs, die evolutionäre Analyse und die funktionale Analyse verwendet werden. Vor diesen Schritten müssen jedoch die Rohsequenzdaten vorverarbeitet und normalisiert werden. Die Datenvorverarbeitung umfasst die Entfernung von Adaptern und Barcodes, die Größenwahl, die Entfernung komplexer Reads und die Generierung einzigartiger Reads. Die Normalisierung ist der Prozess, um die Expressionsniveaus zwischen Bibliotheken vergleichbar zu machen. Rfam und miRBase sind zwei gängige Datenbanken für die Analyse kleiner RNAs. Rfam ist eine Open-Access-Datenbank, die Informationen über tRNA, rRNA und snoRNA usw. bereitstellt. miRBase enthält Sequenzen und Annotationen aller bekannten miRNAs über verschiedene Arten hinweg.

Abbildung 7. Der bioinformatische Analyse-Workflow von kleinen RNA-Sequenzierungsdaten (Buschmann et al. 2016).

Datenqualitätskontrolle: Die Zuverlässigkeit der Ergebnisse der Informationsanalyse hängt von der Qualität der Sequenzierungsdaten ab. Daher durchläuft die Roh-sRNA-Sequenzierung strenge Qualitätskontrollprozesse, einschließlich Adaptertrimmen, Entfernung von Sequenzen mit N-Basen, Herausfiltern von niedrigqualitativen Basen und Längenauswahl. Dies gewährleistet den Erwerb hochwertiger Sequenzierungsdaten und erleichtert gleichzeitig die Zählung von kleinen RNA-Arten sowie die Charakterisierung ihrer Längenverteilung.

Referenzgenom-Ausrichtung: Ausgehend von den sauberen Reads, die nach der Längenauswahl aus jeder Probe erhalten wurden, erfolgt die Ausrichtung an das Referenzgenom, gefolgt von einer statistischen Analyse der Ausrichtungsergebnisse.

Bekannte miRNA-Analyse: Die Ausrichtung der Reads an der miRNA-Datenbank ermöglicht die Identifizierung bekannter Mikro-RNAs.

ncRNA-Analyse: Die Ausrichtung von Reads auf artspezifische ncRNA-Sequenzen oder die Rfam-Datenbank erleichtert die Identifizierung von rRNA, tRNA, snRNA und snoRNA.

Neuartige miRNA-Vorhersage: Die Nutzung von miREvo zur Vorhersage neuer miRNAs, begleitet von Analysen der Nukleotidpräferenz und der Sekundärstruktur.

Genexpression und differenzielle Analyse: Quantifizierung bekannter und neuartiger miRNAs basierend auf den Auswertungsergebnissen, gefolgt von einer differentiellen miRNA-Analyse zur Aufklärung der differentiellen Expression zwischen Proben oder Gruppen.

miRNA-Zielgenvorhersage: Nutzung der Software-Tools miRanda und RNAhybrid zur Vorhersage von differentiellen miRNA-Zielgenen.

Funktionale Anreicherung: Durch die Nutzung von funktionalen Annotationsdatenbanken wie GO und KEGG wird eine signifikante Anreicherung funktionaler Informationen zu differentiell exprimierten miRNA-Zielgenen zwischen Proben oder Gruppen erzielt.

Anwendung von Small RNA-Sequenzierung

Kleine RNA-Sequenzierung ist eine entscheidende Technik in der Biologie, die in verschiedenen Forschungsbereichen weit verbreitet ist, insbesondere in der Genregulation, der Krankheitsdiagnose und der biomedizinischen Untersuchung.

miRNA-Expressionsanalyse:

Mikro-RNAs (miRNAs) sind essentielle nicht-kodierende RNAs, die an der Regulierung der Genexpression beteiligt sind. Kleine RNA-Sequenzierung ermöglicht eine umfassende und hochdurchsatzfähige Bewertung der miRNA-Expressionsniveaus und beleuchtet damit die funktionalen und regulatorischen Netzwerke von miRNAs innerhalb von Organismen.

miRNA-Funktionsforschung:

Nutzung kleine RNA-Sequenzierung ermöglicht die Identifizierung von miRNA-Zielgenen und die weitere Erforschung der gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen miRNAs und ihren Zielen. Dieser Ansatz geht tief in die Aufschlüsselung der biologischen Funktionen und regulatorischen Mechanismen von miRNAs.

Biomarker-Entdeckung:

Angesichts der entscheidenden Rolle von miRNAs beim Ausbruch und Fortschreiten zahlreicher Krankheiten stellt das Sequenzieren kleiner RNAs ein leistungsfähiges Werkzeug zur Entdeckung von krankheitsassoziierten miRNAs dar. Folglich bietet es Potenzial Biomarker zur Krankheitsdiagnose und therapeutischen Interventionen.

Untersuchung von miRNA-Krankheitsassoziationen:

Durch den Vergleich der miRNA-Expressionsprofile in gesunden und kranken Zuständen ist es möglich, krankheitsassoziierte miRNAs zu erkennen. Diese Enthüllung könnte bedeutende Einblicke in die Aufklärung der Krankheitsentstehung bieten und innovative Behandlungsmethoden hervorbringen.

Forschung zu miRNA-Arzneimittel-Interaktionen:

Kleine RNA-Sequenzierung kann die Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen miRNAs und Arzneimitteln erleichtern. Dazu gehört der Einfluss von pharmazeutischen Verbindungen auf die miRNA-Expression sowie die regulatorische Rolle von miRNAs im Arzneimittelstoffwechsel und der therapeutischen Wirksamkeit.

Untersuchungen zur biologischen Evolution:

Die vergleichende Analyse von miRNA-Expressionsprofilen zwischen verschiedenen Arten oder Individuen durch kleine RNA-Sequenzierung Spotlight kann die Konservierung und Vielfalt von miRNAs im evolutiven Prozess von Organismen hervorheben.

Forschung zur Umweltstressreaktion:

Angesichts der entscheidenden Rolle von miRNA in der Reaktion eines Organismus auf Umweltstress, die Anwendung von kleine RNA-Sequenzierung bietet eine Methode, um zu untersuchen, wie dieser Stress das miRNA-Expressionsprofil beeinflusst und somit die zugrunde liegenden Mechanismen der biologischen Anpassung zu erforschen.

Abbildung 8. Anwendungen von kleinen RNA-Modifikationen. (Xiong et al., 2023)

Für detailliertere Bioinformatik-Pipeline für kleine RNA-Sequenzierung, bitte beziehen Sie sich auf diese Seite. Zusätzlich zu kleine RNA-Sequenzierung, wir bieten außerdem andere an transkriptomische Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich RNA-Seq, bakterielle RNA-Sequenzierung, lncRNA-Sequenzierung, circRNA-Sequenzierung und Degradom-Sequenzierung.

Referenzen:

1. Baran-Gale J, Kurtz C L, Erdos M R, et al. Bias in der Vorbereitung von kleinen RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung angehen: Ein neues Protokoll stellt Mikro-RNAs wieder her, die von aktuellen Methoden nicht erfasst werden. Grenzen der Genetik, 2015, 6(e73240).
2. Buschmann D, Haberberger A, Kirchner B, et al. Auf dem Weg zu zuverlässigen Biomarker-Signaturen im Zeitalter der Flüssigbiopsien - wie man den Workflow der kleinen RNA-Sequenzierung standardisiert. Nukleinsäureforschung, 2016, 44(13): 5995-6018.
3. Fuchs R T, Sun Z, Zhuang F, et al. Der Bias bei der Konstruktion von Ligation-basierten kleinen RNA-Sequenzierungsbibliotheken wird durch Adapter und RNA-Struktur bestimmt. PLOS ONE, 2015, 10(5): e0126049.
4. Benesova S, Kubista M, Valihrach L. Small RNA-Sequenzierung: Ansätze und Überlegungen zur miRNA-Analyse. Diagnostik, 2021, 11(6): 964.
5. Xiong Q, Zhang Y. Kleine RNA-Modifikationen: regulatorische Moleküle und potenzielle Anwendungen. Zeitschrift für Hämatologie und Onkologie, 2023, 16(1): 64.