Hochdurchsatz-Einzelzell-V(D)J-Sequenzierung: Einführung, Prinzip und Arbeitsablauf

Vielfalt und molekulare Mechanismen der spezifischen Immunität

Das Immunsystem wird in unspezifische und spezifische Immunität unterteilt, je nachdem, ob es auf das "Nicht-Selbst" ausgerichtet ist oder nicht. Die molekulare Grundlage der spezifischen Immunität, die auf das "Ziel" ausgerichtet ist, wird durch die T-Zell-Immunrezeptor/B-Zell-Immunrezeptor-Proteine (TCR/BCR) angenommen, die auf der Oberfläche von T/B-Lymphozyten exprimiert werden, wobei ein "Nicht-Selbst" einem TCR oder BCR entspricht.

Es gibt unzählige Krankheitserreger in der Natur, aber menschliche Zellen haben nur etwa 25.000 Gene. Wie decken sie also den Bedarf für TCR/BCR VielfaltDie Antwort hängt mit dem hohen Grad an Umordnung der Gene zusammen, die TCR/BCR kodieren.

VDJ-Rekombination im Immunsystem. (Kaeser et al. 2020)

Die hochvariablen Regionen im TCR/BCR-Molekül werden durch Kombinationen von V-, D- und J-Genen kodiert, und eine Vielzahl von TCR/BCRs wird durch hochgradige Genumstellungen wie modulare Kombinationen von Permutationen und Mutationen erzeugt. Im BCR gibt es beispielsweise etwa 40 verschiedene V-Module, 25 verschiedene D-Module und 6 verschiedene J-Module im menschlichen Gen. Die B-Zellen wählen jeweils eines der V-, D-, J- und C-Genmodule aus, splicen diese zusammen und setzen ein reifes BCR-kodierendes Gen zusammen, was zu 2400 Kombinationen führt.

Ähnlich durchlaufen T-Zellen eine Genumordnung, um Vielfalt zu erzeugen. TCRsDer Prozess der TCR-Genumordnung umfasst jedoch die Selektion und Umordnung von variablen (V), verbindenden (J) und konstanten (C) Genabschnitten. Die Kombination verschiedener V- und J-Genabschnitte trägt zur Vielfalt der TCRs bei.

Bitte beziehen Sie sich auf unseren Artikel. Strategieübersicht für TCR-Profiling auf Basis der Next-Generation-Sequenzierung für detaillierte Informationen.

In Bezug auf die Unterschiede in der Reaktion auf das neue Coronavirus (SARS-CoV-2) kann die Variabilität der TCRs und BCRs zwischen Individuen zu Variationen in den Immunantworten beitragen. Einige Menschen haben möglicherweise TCRs und BCRs, die besser geeignet sind, das Virus zu erkennen und zu bekämpfen, was zu einer milderen oder asymptomatischen Infektion führt. Im Gegensatz dazu können Personen mit TCRs und BCRs, die weniger effektiv im Erkennen des Virus sind, schwerere Erkrankungen erleben.

Um ein tieferes Verständnis der Arten und quantitativen Unterschiede von TCR- und BCR-Molekülen in Immunantworten zu erlangen, können Forscher hochdurchsatzfähige Einzelzell-V(D)J-Sequenzierung einsetzen. Diese Technologie ermöglicht die Analyse einzelner T- oder B-Zellen und liefert Einblicke in die Vielfalt und Zusammensetzung des Immunrepertoires auf Einzelzellebene. Solche Studien können zu unserem Verständnis der Immunantworten auf Infektionen, Autoimmunerkrankungen und andere immunbezogene Störungen beitragen.

Einführung in die Einzelzell-V(D)J-Sequenzierungstechnologie

Hochdurchsatz-Einzellzelle V(D)J-Sequenzierung Die Technologie ist in der Lage, mRNA aus Tausenden von Einzelzellen gleichzeitig auf Einzelzellebene zu erfassen und die V(D)J-Genexpressionsinformationen für jede T-Lymphozyte und B-Lymphozyte zu erhalten, während das vollständige Genexpressionsprofil jeder Zelle erfasst wird.

Um den Anforderungen von "High-Throughput" und "Einzelzelle" gerecht zu werden, wird das hochdurchsatzfähige Einzelzell-V(D)J-Sequenzieren hauptsächlich durch den Einsatz von Tropfen-Mikrofluidik-Chips und Mikrosphären mit molekularen Markierungen erreicht.

Eine Einzelzellensuspension, die durch Proben-Dissociation gewonnen wurde, molekular markierte Mikrokugeln, ein Reverse-Transkriptions-Kit und Tropf-Generierungsöl werden in die angereicherten Wells des Tropf-Mikrofluidik-Chips gegeben.

Durch die Kontrolle der Durchflussrate von Mikrosphären, Zellen und Reagenzien im mikrofluidischen Flusskanal können die Mikrosphären, Zellen und Reagenzien im gewünschten Verhältnis kombiniert und schließlich durch die wässrige Phase in die Ölphase überführt werden, wodurch die Zellen und Mikrosphären in der Öl-in-Wasser-Emulsion eingeschlossen werden und somit ein Einzelzellzustand entsteht.

Nachdem die Zellen in das Öl-in-Wasser eintreten, zerreißt die Zellmembran, um mRNA-Moleküle freizusetzen. mRNA-Moleküle werden von Strukturen wie polyT oder C-C-C am Ende der Millionen einzelsträngigen Oligos, die auf den Mikrosphären getragen werden, eingefangen. Jedes Oligo trägt sowohl einen Zellbarcode als auch ein Transkriptlabel (molekulare Barcodes), sodass selbst wenn zehntausende von Zellen für nachfolgende Reverse-Transkription und Bibliothekskonstruktionsexperimente gemischt werden, die Bibliotheksdaten dennoch auf jede Zelle aufgeteilt und durch Verwendung des Zellbarcodes und molekularer Barcodes während der Datenanalysephase auf das tatsächliche Genexpressionsniveau zurückgeführt werden können.

Bitte lesen Sie unseren Artikel. Immunspektrum-Sequenzierung: Einführung, Arbeitsablauf und Anwendungen für weitere Informationen.

Workflow der Einzelzell-V(D)J-Sequenzierung

Die Hochdurchsatz-Einzelzell-V(D)J-Sequenzierung erfordert ebenfalls die Dissoziation von Gewebeproben in Einzelzell-Suspensionen, gefolgt von der Bildung von Wasser-in-Öl-Strukturen mit mikrofluidischen Chips, um die Einzelzelltrennung abzuschließen, gefolgt von der Erfassung von Nukleinsäuren sowie dem Aufbau von Transkriptom-Bibliotheken und TCR/BCR-Bibliotheken.

Massiv parallele Einzelzell-B-Zell-Rezeptor-Sequenzierung. (Goldstein et al., 2019)

Die Hauptschritte von der Zellisolierung bis zur Bibliothekskonstruktion sind wie folgt:

Schritt 1: In der Wasser-in-Öl-Struktur wird die Zellmembran aufgelöst, um intrazelluläre mRNA-Moleküle freizusetzen.

Schritt 2: mRNA-Moleküle werden durch Reverse Transkriptase in einzelsträngige cDNA synthetisiert. cDNA-Moleküle werden von Oligonukleotiden mit Zellbarcode erfasst und weiter zu doppelsträngigen DNA-Molekülen synthetisiert. In diesem Prozess wird jedes DNA-Molekül mit einem Zelllabel versehen.

Schritt 3: Nehmen Sie einige dieser doppelsträngigen cDNA-Moleküle, um den Aufbau und die Sequenzierung einer vollständigen Genexpressionsprofil-Transkriptombibliothek abzuschließen (cDNA-Moleküle aus allen Zellen werden in diesem Prozess gemischt, um eine multizelluläre Hybridbibliothek zu erstellen).

Schritt 4: Nehmen Sie einige der doppelsträngigen cDNA-Moleküle und vervollständigen Sie den Aufbau der V(D)J-Bibliothek und die Sequenzierung, indem Sie die Primer der konservierten Region des V(D)J-Gens kombinieren (alle cDNA-Moleküle der Zellen werden in diesem Prozess zusammengeführt, um eine multizelluläre Hybridbibliothek zu erstellen).

In der anschließenden Datenanalysephase können die Transkriptom-Bibliothek und die V(D)J-Bibliothek auf die Einzelzell-Ebene basierend auf Zell-Tags reduziert werden, die verwendet werden können, um das Genexpressionsprofil und die V(D)J-Genexpressionsinformationen jeder Zelle zu verstehen. Das vollständige Genexpressionsprofil jeder Zelle, kombiniert mit Marker-Genen, die spezifisch in verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, ermöglicht die zelluläre Annotation jeder Zelle, um die in jeder Probe vorhandenen Zelltypen, die Anzahl jeder Zelle und die Genexpression jeder Zelle zu verstehen. In Kombination mit der V(D)J-Bibliothek ist es möglich zu wissen, welches V(D)J-Gen in jedem T- oder B-Lymphozyten exprimiert wird und welches TCR/BCR-Molekül ihm entspricht.

Referenzen:

1. Kaeser, Gwendolyn, und Jerold Chun. "Somatische Genrekombination von Gehirnzellen und ihre phylogenetischen Grundlagen." Journal für biologische Chemie 295,36 (2020): 12786-12795.
2. Goldstein, Leonard D., et al. "Massiv parallele Einzelzell-B-Zell-Rezeptor-Sequenzierung ermöglicht die schnelle Entdeckung vielfältiger antigenreaktiver Antikörper." Kommunikationsbiologie 2.1 (2019): 304.