Strategieübersicht für TCR-Profiling basierend auf Next-Generation Sequencing

Überblick über T-Zell-Rezeptoren (TCRs)

Das menschliche adaptive Immunsystem steuert die Immunantwort über von B-Zellen erzeugte Immunglobuline und immunoglobulinähnliche T-Zell-Rezeptoren (TCRs) auf T-Lymphozyten. TCRs sind verantwortlich für die Erkennung der Ag-MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex)-Moleküle. TCRs bestehen normalerweise aus hochvariablen α- und β-Ketten, die von der Mehrheit der T-Zellen exprimiert werden, oder γ- und δ-Ketten, die von einer Untergruppe der T-Zellen (1–5%) exprimiert werden. Die TCR-Ketten bestehen aus einem variablen Bereich zur Antigen-Erkennung und einem konstanten Bereich. Der variable Bereich der α- und δ-Ketten wird durch variable (V) und verbindende (J) Gene kodiert, während β- und γ-Ketten durch Diversitäts (D) Gene kodiert werden. Jede TCR-Kette enthält drei hypervariable Schleifen, d.h. komplementäre Bestimmungsregionen (CDR1–3). Die Antigenspezifität der TCRs wird hauptsächlich durch die hypervariable CDR3 der Beta-Kette bestimmt, die durch Rekombination von V-, D- und J-Genfragmenten mit der Hinzufügung von zufälligen Nukleotiden an den Genfragmentübergängen gebildet wird. Die Summe aller TCRs eines menschlichen Körpers wird als TCR-Repertoire oder TCR-Profil bezeichnet, das sich mit dem Beginn und dem Fortschreiten von Krankheiten erheblich ändern kann. Daher ist es wichtiger, den Status des Immunrepertoires unter verschiedenen Krankheitsbedingungen zu bestimmen.

Abbildung 1. Interaktion zwischen einer antigenpräsentierenden Zelle (APC) und einer T-Zelle (a) sowie V(D)J-Rekombination (b) (Rosati) u. a.., 2017).

TCR-Sequenzierung

Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat das TCR-Repertoire-Profiling revolutioniert, indem sie die Möglichkeit bietet, TCR- und Antikörper-Repertoires aus Blutproben massiv zu analysieren. Wir konzentrieren uns hauptsächlich auf zellpopulationbasierte TCR-Sequenzierung in dieser Bewertung.

• Ketten oder CDR-Regionen

γδ T-Zellen sind weniger interessant, da sie häufig an mukosalen Stellen vorkommen. Die β-Kette ist das Hauptziel von Interesse aufgrund ihrer Einzigartigkeit in Einzelzellen und des höheren kombinatorischen Potenzials im Vergleich zu α-Ketten. PCR-basierte Methoden können sowohl α- als auch β-Ketten gleichzeitig amplifizieren, werden jedoch oft während der Sequenzierung getrennt, um die Präzision und Spezifität des Ergebnisses zu erhöhen.

Die CDR3-Region war ein bevorzugtes Ziel in vielen TCR-Profilierungsstudien. Obwohl CDR1 und CDR2 nicht direkt mit Antikörpern interagieren, spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Kontaktaufnahme mit den MHC-Molekülen und beeinflussen somit die Sensitivität und Affinität der TCR-Bindung.

• Bibliotheksvorbereitung

Es gibt drei gängige Methoden zur Erstellung von TCR-Profiling-Bibliotheken: Multiplex-PCR, Zielanreicherung und 5'RACE cDNA-Synthese sowie nested PCR (Abbildung 2). Molekulare Barcodes wurden während der cDNA-Synthese eingeführt, um die Auswirkungen von PCR- und Sequenzierungsfehlern zu minimieren.

Unter ihnen, Multiplex-PCR Ansätze sind die gängigsten und können sowohl für gDNA als auch für RNA verwendet werden. Allgemein werden Primer für die J-Allele oder die konstante Region der α- und β-Ketten sowie Primer für alle bekannten V-Allele verwendet, um das TCR-Transkript über den CDR3-Bereich zu amplifizieren. Diese Methode kann jedoch neuartige V-Allele-Varianten nicht nachweisen und kann Amplifikationsverzerrungen einführen.

Sowohl Agilent (SureSelectXT) als auch Illumina (TruSeq) bieten an gezielte Anreicherung-basierte Kits zur Erfassung von TCRs von αβ T-Zellen. RNA oder gDNA werden vorverarbeitet und dann mit maßgeschneiderten RNA-Baits inkubiert, um mit dem gDNA/cDNA-Ziel zu hybridisieren, gefolgt von einem weiteren Amplifikationsschritt. Zielanreicherungsmethoden sind weniger anfällig für PCR-Bias.

Für RNA-Proben, schnelle Amplifikation der 5' komplementären DNA-Enden (5'Rennen) basierend auf der Template-Switch-Technologie wird zum Goldstandard für umfangreiche TCR-Studien. Vermarktet von Clonotech als "SMART"-Technologie ermöglicht diese Methode die Anreicherung aller TCR-Varianten in der Probe. Clonotech hat ein kommerzielles Kit für TCR-Studien entwickelt. Die cDNA-Synthese erfolgt unter Verwendung von Primern gegen die konstante Region des TCR-mRNA-Transkripts. Anschließend wird ein nested PCR wird durchgeführt, um die konstante Region zu amplifizieren.

Abbildung 2. Arbeitsablauf der drei Hauptmethoden zur TCR-Bibliotheksvorbereitung (Rosati) u. a.., 2017).

• Sequenzierung

Die Tiefensequenzierung ermöglicht den Erwerb eines vollständigeren TCR-Repertoires. Für krankheitsorientierte Studien, die nach hoch exprimierten TCRs suchen, kann jedoch eine oberflächliche Niedrigdurchsatzsequenzierung ausreichend sein. In diesem Fall wird häufig die Illumina MiSeq verwendet, während die Illumina HiSeq häufiger für die Tiefensequenzierung eingesetzt wird.

TCR-Profiling aus RNA-Seq-Daten

Als Transkriptom-Sequenzierung wird routinemäßig in grundlegenden und klinischen Studien verwendet, könnte es eine wichtige Quelle für die TCR-Profilierung darstellen. Mehrere Gruppen haben Werkzeuge zur Extraktion des TCR-Repertoires aus Bulk- oder Einzelzell-RNA-seq-Daten entwickelt, wie zum Beispiel MiXCR. Dieses Werkzeug zielt darauf ab, so viele CDR3-Sequenzen wie möglich zu extrahieren, jedoch kaum ohne falsch-positive Ergebnisse.

Referenzen:

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