Phagenanzeige und NGS: Wie die Next-Generation-Sequenzierung Phagenbibliotheken verbessert

Phagenanzeige dient als grundlegende Technologie in der Arzneimittelentdeckung und Proteinengineering und ermöglicht das Screening von funktionalen Peptiden, Antikörpern und Proteinvarianten über verschiedene genetische Repertoires hinweg. Dieser Ansatz basiert auf dem Aufbau von Bibliotheken mit außergewöhnlicher Sequenzvielfalt, die typischerweise 10^11 einzigartige Varianten überschreiten.

Traditionelle Screening-Methoden stoßen bei der Bewältigung solcher Komplexität auf erhebliche Einschränkungen. Die Zusammensetzung der Bibliothek bleibt undurchsichtig, die Dynamik der Anreicherung von Zielklonen ist schlecht aufgelöst, und die Ergebnisse hängen stark von mühsamer monoklonaler Validierung ab. Diese Einschränkungen führen zu ineffizienten, teilweise blinden Auswahlprozessen.

Next-Generation-Sequenzierung (NGS) transformiert dieses Paradigma durch hochdurchsatzfähige, kosteneffektive Tiefensequenzierung. Seine Fähigkeit, Sequenzräume schnell zu scannen, hat die Phagenanzeige-Workflows revolutioniert.

Die NGS-Lösung: Eine Multi-Tool-Plattform

1. Total Quality Control (TQC) über NGS

• Technologie: Ersetzt die Niedrigdurchsatz-Sanger-Sequenzierung durch Massive Parallel Sequenzierung (NGS), um Millionen von Phagenpartikeln zu analysieren.
• Durchbruch: Erreicht ein globales, umfassendes Profil der Bibliothekszusammensetzung, das die Dimensionen traditioneller Methoden bei weitem übersteigt.
• Kernqualitätsbewertungen:
  • Funktionale Diversität: Quantifiziert die Anzahl der tatsächlich effektiven Klone.
  • Designabdeckung: Bewertet, ob alle entworfenen Mutationskombinationen angemessen repräsentiert sind.
  • Systemeinstellungen-Diagnose: Identifiziert Verzerrungen aus der Konstruktion (z. B. ineffiziente Ligation, Sequenzverlust, toxische Sequenzdepletion).
• Leserahmenintegrität: Stellt sicher, dass die offenen Leserahmen korrekt sind und keine Stoppcodons enthalten.
• Vorteil: Ermöglicht die frühzeitige Erkennung defekter Bibliotheken und leitet die Optimierung von Parametern und Strategien zur Verbesserung der Funktionalität und Repräsentativität, wodurch Ressourcen geschont werden.

2. Echtzeitüberwachung des Screening-Prozesses

• Transformation: Wandelt das traditionelle "Black Box"-Screening in einen dynamisch nachverfolgbaren und beobachtbaren Prozess um.
• Methode: Beinhaltet das tiefe Sequenzieren der Bibliothek vor und nach jeder Runde (Bindung, Waschen, Elution, Amplifikation), um Einblicke auf molekularer Ebene zu bieten.
• Fähigkeiten:
  • Verfolgt Frequenzänderungen einzelner Klone über die Screening-Runden hinweg.
  • Identifiziert direkt Sequenzen, die durch Selektionsdruck angereichert oder verringert sind.
  • Entdeckt konservierte Reste, Domänen oder Bindungsmotive durch mehrfache Ausrichtung.
• Diagnosefunktion: Daten dienen als diagnostisches Werkzeug (z. B. deuten Anreicherungsplateaus auf zu strenge Bedingungen hin; der Verlust an Vielfalt weist auf Amplifikationsbias hin).
• Vorteil: Ermöglicht Echtzeit-Anpassungen der Screening-Strategie auf der Grundlage von Daten (z. B. Optimierung der Strenge, Anpassung der Eingaben), um die Effizienz und Erfolgsquoten erheblich zu verbessern.

3. Direkte Entdeckung von Kandidatenmolekülen

• Zeitpunkt: In späteren Screening-Runden (typischerweise 2-4) zeigen NGS-Daten deutlich die am stärksten angereicherten Klone und dominanten Sequenzfamilien.
• Effizienzsteigerung: Umgeht vollständig die zeitaufwändigen traditionellen Schritte des zufälligen Auswählens, Kultivierens und Sanger-Sequenzierens von Hunderten von Klonen.
• Arbeitsablauf:
  • Wählen Sie die besten Kandidatensequenzen basierend auf der NGS-Anreicherungseinstufung und Integritätsdaten aus.
  • Synthese von Oligonukleotiden für die schnelle rekombinante Proteinexpression.
  • Schnelle Validierung von Kandidaten mithilfe von Hochdurchsatztechniken (z. B. ELISA, SPR, funktionale Assays).
• Hauptvorteil: Verkürzt drastisch den Zeitraum von der Screening-Ende bis zum Erwerb validierter Moleküle und spart Wochen oder sogar Monate an F&E-Zeit.

Weitere Phagen-NGS-Sequenzierungsmethoden sind verfügbar als Referenz: "Next-Generation Sequencing for Phage Analysis: A Modern Approach".

Das Verständnis der Rolle von NGS-Daten in der Qualitätskontrolle von Phagen-Display-Bibliotheken kann in "Qualitätskontrolle für Phagen-Display-Bibliotheken mit NGS-Daten" nachgelesen werden.

Fallstudien: NGS in Aktion

Fallstudie 1: Zähmung des Verstärkungsbias

• Dynamische Überwachung von Amplifikationsverzerrungen: Quantitative NGS-Analysen zeigten eine erhebliche Verschiebung in der Klonverteilung nach der Amplifikation, gekennzeichnet durch einen starken Anstieg der Wildtyp-Repräsentation (von 10,36 % auf 90,37 % in SA1 und von 5,99 % auf 61,81 % in SA2). Gleichzeitig wurde eine drastische Reduktion der Singleton-Klone beobachtet (z. B. in SA2 von 96,66 % auf 24,6 %), was zeigt, dass der Amplifikationsprozess eine signifikante Homogenisierung der Bibliothek induziert.
• Identifizierung funktioneller Motive: Die Analyse mit dem Anreicherungsfaktor (EF-RRB) identifizierte hoch effiziente Klone, wie z.B. Pr-TUP-Varianten (z.B. in SA2, EF > 126.000). Dieser Ansatz ermöglichte das Verfolgen von mit Amplifikation assoziierten Motiven (z.B. May/Ramay, mit Anreicherungswerten von bis zu 142-fach), während gleichzeitig nicht-funktionale β-Wendungsmotive ausgeschlossen wurden, die keine Anreicherung zeigten (alle ES < 1), unabhängig von der Amplifikationseffizienz.
• Spatiotemporale Aminosäureprofilierung: Die Analyse enthüllte unterschiedliche positionsabhängige Dynamiken, wie einen 3,7-fachen Anstieg der C-terminalen Argininhäufigkeit nach der Amplifikation in SA1 und einen Rückgang von 82 % der N-terminalen Leucin-Häufigkeit in SA2. Darüber hinaus wurden batchspezifische Variationen identifiziert, einschließlich der Überexpression von L-Phenylalanin in SA1 und einer ausgeprägten Tyrosinanreicherung in SA2.
• Leitfaden zur Bibliotheksoptimierung: Die EF-Verteilung zeigte, dass SA1 3,2-mal mehr hyperproliferative Klone (EF > 10²) enthielt als SA2, was die Notwendigkeit unterstreicht, die Amplifikationsrunden zu begrenzen, um Verzerrungen zu vermeiden. Darüber hinaus wurde empfohlen, den L-Cystein-Gehalt unter 1 % zu halten, um potenzielle Störungen durch Disulfidbindungen zu umgehen (Sinkjaer A.W. et al., 2025).

Gestapelte Balkendiagramme, die die Häufigkeitsverteilung von Sequenzen visualisieren, die in NGS-Daten aus den SA1- und SA2-Experimenten beobachtet wurden (Sinkjaer A.W. et al., 2025)

Fallstudie 2: Die verborgene Werkzeugkiste der Natur erschließen

• Hochdurchsatz-Funktionale Gemeinschaftsprofilierung: Durch die Verarbeitung von 691.206 NGS-Reads (bestehend aus 153.002 nicht redundanten Sequenzen) wurde eine umfassende Charakterisierung des mikrobiellen Metasekretoms des Pansens erreicht. Diese Analyse identifizierte 196 CAZyme-Familien, darunter eine 14,3-fache Anreicherung von GH124-Cellulasen, was das Studium der Pansen-Sekretome erheblich über die Grenzen konventioneller Methoden hinaus voranbrachte. Die anschließende Validierung der funktionalen Anreicherung bestätigte die effektive Zielgerichtetheit von extrazellulären Hydrolasen (z. B. CE1/CE3-Esterasen). Bemerkenswerterweise machten Funktionen, die mit dem Kohlenhydrattransport und -stoffwechsel assoziiert sind, 19,4 % des Datensatzes aus und übertrafen die metagenomische Basislinie (10,6 %) um 83 %.
• Überwachung der Screening-Effizienz: Der Prozess zeigte eine hohe Selektivität und führte zu einer 29-fachen Anreicherung sekretorischer Klone. Die Effizienz der PIII-Fusionspräsentation erreichte 94,4 % und übertraf damit die theoretische Erwartung von 3,3 % erheblich. Darüber hinaus identifizierte und eliminierte das System erfolgreich 5,6 % nicht-sekretorischer Klone (z. B. kurze Peptide und intrazelluläre Proteine) und sparte somit Ressourcen, die für deren funktionale Validierung aufgewendet worden wären.
• Gezielte Bibliotheksoptimierung: Die Optimierungsbemühungen konzentrierten sich auf die Auswahl von Signalsequenzen, wobei Typ II/TAT-Weg ausgeschlossen wurde, da diese mit der periplasmatischen Faltung von E. coli inkompatibel sind. Typ I-Signalsequenzen wurden daher priorisiert. Die Analyse der Wirtskompatibilität ergab eine Dominanz von gramnegativen bakteriellen Sequenzen (z. B. 29 % Bacteroidetes), was auf ihre überlegene Anpassung an die Verarbeitungsmaschinerie der Signalsequenzen des Wirts zurückzuführen ist (Ciric M et al., 2014).

Übersicht über den Bau und die Auswahl der Metasecretom-Bibliothek (Ciric M et al., 2014)

Die Zukunft: Intelligente Bibliotheksgestaltung unterstützt durch NGS

NGS übersteigt bloße Screening-Optimierung und entwickelt sich zu einem Katalysator für innovative Bibliotheksarchitekturen:

• Dateninformierte Bibliotheksengineering: Die Integration historischer NGS-Datensätze ermöglicht den Aufbau umfangreicher funktioneller Sequenzdatenbanken. Diese Repositorien beleuchten kritische Beziehungen zwischen Sequenz, Struktur und Funktion, einschließlich der Auswirkungen kombinatorischer Mutationen, Regionen, die struktureller Plastizität zugänglich sind, und wiederkehrender Bindungsmotive. Maschinenlernmodelle, wie neuronale Netze und versteckte Markov-Modelle, können mit diesen Daten trainiert werden, um die Auswirkungen von Punkt- und kombinatorischen Mutationen auf die Bindungsaffinität und -spezifität vorherzusagen. Diese prädiktive Fähigkeit leitet die Optimierung von Mutagenesestrategien – sie informiert über die Auswahl von Stellen, Mutationsarten und -häufigkeiten – und erleichtert sogar das de novo Design von Proteinen, wie am Beispiel der Entwicklung stabiler humanisierter Antikörpergerüste zu sehen ist. Folglich hebt dieser Ansatz das Bibliotheksdesign von einem empirischen Prozess auf eine rationale, datengestützte Strategie an, was die Qualität der ursprünglichen Bibliothek und die anschließende Effizienz der Entdeckung erheblich verbessert.
• Synthese von Bibliotheken und Qualitätskontrolle: Mit den sinkenden Kosten der DNA-Synthese gewinnen vollständig synthetische Bibliotheken (z. B. humanisierte Antikörper-Repertoires und maßgeschneiderte Bindungsdomänenbibliotheken) an Bedeutung, da sie Designflexibilität und die Fähigkeit bieten, immunogene Sequenzen zu umgehen. NGS dient als der definitive Standard für die Qualitätskontrolle dieser Bibliotheken und ermöglicht eine großflächige Überprüfung der Genauigkeit der Oligonukleotid-Poolsynthese durch die Erkennung von Fehlern (Löschungen, Einfügungen, Fehlpaarungen). Es quantifiziert zudem die post-amplifikatorische Diversität, um die Einhaltung der Entwurfsspezifikationen zu bestätigen, und identifiziert Verzerrungen, die während der Synthese- oder Klonierungsabläufe eingeführt wurden. Diese strenge Qualitätskontrolle ist von größter Bedeutung, um sicherzustellen, dass kostspielige synthetische Bibliotheken die beabsichtigten Schwellenwerte für Qualität und Repräsentativität erfüllen, bevor Ressourcen für funktionale Screenings eingesetzt werden.

Fallstudie 1: Bessere Antikörper von Grund auf entwerfen

Qualitätssicherung von synthetischen Bibliotheken

NGS ermöglicht die geschlossene Validierung synthetischer Bibliotheken, indem Millionen von Klonen gescannt werden. Dieser Prozess bestätigt die Kodon-Fidelität (z. B. die Überprüfung eines entworfenen 1:1 Ser/Tyr-Verhältnisses an der CDR3-Position 117), gewährleistet die Integrität des Leserahmens durch die Erkennung von Frameshift-Mutationen und Stopcodon-Kontamination und liefert eine präzise Quantifizierung der Diversität – indem 1,75×10⁸ einzigartige Klone genau gemessen werden, eine Zahl, die traditionelle Schätzungen basierend auf der Transformations-Effizienz übertrifft.

Struktur-Wirkungs-Beziehungsmodellierung

Die konformationale Analyse von NanoNet wurde an 10.000 NGS-validierten Nanobody-Sequenzen durchgeführt. Die Simulationen zeigten, dass 14-Aminosäure-CDR3-Schleifen eine exklusive gebogene Konformation annehmen, was eine klare strukturelle Abweichung von der erweiterten Topologie zeigt, die in kürzeren 10-Aminosäure-Schleifen beobachtet wird. Dieser strukturelle Einblick deutet darauf hin, dass eine verlängerte CDR3-Länge die molekulare Fitness für die Interaktion mit konkaven Bindungsoberflächen verbessert.

Stabilitätsoptimierungsstrategien

Um die Stabilität zu erhöhen, leitete NGS-Daten die Eliminierung von oberflächenexponierten hydrophoben Clustern ein, um die Aggregationsneigung zu verringern. Darüber hinaus wurde polare Ingenieurtechnik eingesetzt, um strategisch hydrophile Reste einzuführen (z. B. >80 % polare Aminosäureinhalte an spezifischen Stellen wie CDR1-Asn31), wodurch die Löslichkeit und strukturelle Integrität des Proteins verbessert wurde.

Durchbruchinnovationen

Diese Forschung hat das Design von Bibliotheken transformiert, indem sie von empirischen Ansätzen zu einer strukturbasierten, rationalen Strategie übergegangen ist, die auf über 600 Nanobody-PDB-Strukturen basiert. Ein entscheidender Durchbruch ist das Überwinden natürlicher immunologischer Einschränkungen, da synthetische Bibliotheken CDR3-Längen von über 24 Aminosäuren ermöglichen. Die resultierenden stabilisierten Rahmenbedingungen ermöglichen die gezielte Ansprache intrazellulärer Protein-Protein-Interaktionen, die zuvor als unzugänglich galten, während die templatierten Architekturen eine schnelle Iteration von CDR-Längenvarianten ermöglichen und neue Wege für die therapeutische Entwicklung eröffnen (Moreno E et al., 2022).

Aminosäurehäufigkeiten pro randomisierter Position für die konstruierte Bibliothek (Moreno E et al., 2022)

Herausforderungen und zukünftige Richtungen

Trotz der durch NGS bedingten Transformation bestehen weiterhin wesentliche Einschränkungen:

Technische Einschränkungen

• Verstärkungsbias:
  • PCR während der Bibliotheksvorbereitung verzerrt die Sequenzfrequenzdarstellung. Minderungstrategien umfassen:
    • Hochfidelity-Polymerasen;
    • Optimierte Zykluszahlen;
    • Molekulare Barcodes.
• Leselängenbeschränkungen: Kurzleseplattformen (z. B. Illumina) erfordern eine Zusammenstellung der Reads für große Inserts (z. B. scFv-Fragmente), was die Genauigkeit in komplexen variablen Regionen beeinträchtigen kann. Während Langlesetechnologien (PacBio, Oxford Nanopore) Lösungen anbieten, bleibt es eine Herausforderung, Kosten, Durchsatz und Genauigkeit in Einklang zu bringen.

Rechnerische Anforderungen

• Datenverarbeitungs-Komplexität:
  • Die Verwaltung massiver NGS-Datensätze erfordert ausgeklügelte bioinformatische Pipelines für:
    • Qualitätskontrolle und Duplikatbereinigung;
    • Sequenzassemblierung/-annotation;
    • Ausrichtung, Frequenzanalyse und differentielle Anreicherung;
    • Motiventdeckung

Dies erfordert erhebliche Anforderungen an Rechenressourcen und Fachwissen.

Wirtschaftliche Überlegungen

• Kosten-Nutzen-Bilanz: Trotz sinkender Sequenzierungskosten verursachen tiefgehende Sequenzierungen großer Bibliotheken – insbesondere über mehrere Screening-Runden hinweg – erhebliche Ausgaben. Die strategische Ressourcenallokation muss mit dem Projektumfang und den Budgetbeschränkungen übereinstimmen.

Fazit: Das Unentbehrliche Mikroskop

NGS hat die Phagen-Display-Technologie grundlegend transformiert und bietet beispiellose molekulare Einblicke, Prozesskontrolle und Screening-Effizienz. Durch die Installation eines "hochauflösenden molekularen Mikroskops" in den Abläufen der Bibliothekskonstruktion und Biopanning wandelt NGS traditionell intransparente Prozesse in quantitativ analysierbare, dynamisch optimierbare Systeme um.

• Ermöglichte Schlüsselentwicklungen umfassen:
  • Umfassende Bibliothekscharakterisierung;
  • Echtzeit-Panning-Überwachung;
  • Präzise Identifizierung von wertvollen Klonen;
  • Datengetriebenes intelligentes Bibliotheksdesign;
  • Strenge Qualitätskontrolle synthetischer Bibliotheken.

Diese Fähigkeiten beschleunigen die gezielte Entdeckung von Molekülen (Antikörpern, Liganden) und erhöhen die Erfolgsquoten. Über die Optimierung hinaus erweitert NGS die Innovationsgrenze der Technologie – demonstriert durch unsere kosteneffiziente Implementierung hybrider Bibliotheken.

Zukünftige Entwicklung

• Die Synergie der NGS-Phagenanzeige wird weiterhin Durchbrüche in folgenden Bereichen vorantreiben:
  • Entwicklung therapeutischer Antikörper;
  • Präzise Protein-Engineering;
  • Fortgeschrittenes Biosensordesign;
  • Fundamentale Studien zu molekularen Wechselwirkungen.

Bei der Erkundung funktioneller Landschaften von Proteinen erweist sich NGS als unverzichtbares Werkzeug – es ermöglicht Wissenschaftlern, funktionale Schätze aus molekularen Ozeanen mit unübertroffener Präzision und Effizienz zu bergen.

Für einen detaillierteren Ansatz zur Phagen-Sequenzierung beziehen Sie sich bitte auf "Phagenom-Sequenzierung: Methoden, Herausforderungen und Anwendungen.

Für weitere Informationen zur Sequenzierung des M13-Phagen siehe "M13-Phagen-Genomsequenzierung: Von Display-Bibliotheken zur Datenanalyse.

Die Leute fragen auch

Was sind die Vorteile der Phagenanzeige?

Eine seiner wichtigsten Stärken ist das Hochdurchsatz-Screening, das es Forschern ermöglicht, Zielantigen-Binder in einem einzigen Experiment schnell zu identifizieren.

Wie funktionieren Phagen-Display-Bibliotheken?

Die Phagen-Display-Bibliothek wird mit dem Zielmolekül, das auf einem festen Träger immobilisiert ist, inkubiert. Spezifische Bibliotheksphagen binden an das Molekül, und ungebundene Phagen werden ausgewaschen. Die spezifischen Phagen werden eluiert und in Bakterien amplifiziert.

Was ist Phagen-Display und warum war es nützlich für die gerichtete Evolution?

Geleitete Evolution durch Phagenanzeige | LIPhy - Universität ...

Phagenanzeige ist eine Technik der gezielten Evolution, die verwendet wird, um Proteine (Antikörperfragmente) oder Peptide mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen und zu optimieren.

Was ist das Prinzip der Phagenanzeige?

Phagenanzeige - Wikipedia

Bei dieser Technik wird ein Gen, das für ein Protein von Interesse kodiert, in ein Gen für ein Phagenhüllprotein eingefügt, wodurch der Phage das Protein auf seiner Außenseite "anzeigt", während er das Gen für das Protein in seinem Inneren enthält, was zu einer Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp führt.

Was ist der Unterschied zwischen Phagen-Display und Ribosomen-Display?

Phagenanzeige – nutzt Bakteriophagen, um Peptide/Proteine auf ihrer Oberfläche zu präsentieren. Ribosomenanzeige – zellfreies System, das einen Komplex aus mRNA, Ribosom und naszentem Protein aufrechterhält.

Referenzen:

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