M13-Phagen-Genomsequenzierung: Von Display-Bibliotheken zur Datenanalyse

Bakteriophage M13, ein filamentöser Virus, besitzt ein einzelsträngiges zirkuläres DNA-Genom von etwa 6,4 kb Größe. Seit Frederick Smith in den 1980er Jahren seine Verwendung für "Phagen-Display" einführte, hat sich M13 zu einer entscheidenden Plattform in der biomedizinischen Forschung und Entwicklung entwickelt. Diese Technologie hat den Fortschritt in der Antikörpertechnik, der Entdeckung von Peptidmedikamenten und dem Design von Nanocarriern erheblich beschleunigt. Daher ist es entscheidend, eine genaue Sequenzierung sowohl des nativen M13-Genoms als auch aller eingefügten genetischen Elemente zu erreichen. Eine solche Präzision gewährleistet die Qualität der Bibliothek und erleichtert die Identifizierung funktioneller Moleküle. Dieser Artikel wird eine detaillierte Untersuchung von M13 bieten. Phagenbibliothekskonstruktion und anschließende Datenanalysemethoden.

Grundstruktur des M13-Bakteriophagen und der mögliche Weg der Gentechnik (Moon JS et al., 2019)

Das grundlegende Prinzip des M13-Phagenbibliotheksaufbaus

Kernstruktur des M13-Phagen-Display-Systems

1. Genomstruktur und funktionale Module

Der M13-Phage besitzt ein 6,4 kb großes zirkuläres einzelsträngiges DNA (ssDNA) Genom, das 11 Gene (gI-gXI) kodiert, die funktionell wie folgt kategorisiert sind:

• Replikationsgene (gII, gV, gX): Steuern die DNA-Replikation und Verpackung von Phagen.
• Strukturelle Protein-Gene:
  • gVIII (pVIII): Kodiert das Hauptkapsidprotein (ungefähr 2700 Kopien pro Virion), das das helikale Kapsidtube bildet.
  • gIII (pIII): Kodiert ein minor Kapsidprotein (5 Kopien pro Virion), das für die Wirtsanerkennung und Infektion durch Bindung an bakterielle F-Pili unerlässlich ist.
• Assemblierungs-/Sekretionsgene (gI, gIV, gVI, gVII, gIX): Vermitteln die transmembrane Sekretion und die Virionassemblierung.

Schematische Darstellung der Struktur des M13-Phagen und des Mechanismus des Anzeige-Systems (Wang R et al., 2023)

2. Molekulare Grundlagen von Display-Strategien

Die Machbarkeit der Anzeige hängt entscheidend von den strukturellen Einschränkungen und der Kopienzahl des gewählten Fusionsstandorts ab:

• pIII N-terminal: Niedrige Kopienzahl (1-5/phage). Geeignet zur Anzeige großer Proteine (z.B. scFv, Fab), erfordert jedoch den Erhalt der C-terminalen Domäne (CT, einschließlich NT1/NT2), um die Infektiosität zu bewahren.
• pVIII N-Terminus: Hohe Kopienzahl (>2000/Phage). Primär geeignet für kurze, hydrophile Peptide (<10 Aminosäuren), um eine Störung der Kapsidassemblierung zu verhindern.
• pVI C-terminal: Niedrige Kopienzahl (1-5/Phage). Ermöglicht die intrazelluläre Proteindisplay, erfordert koordinierte Sekretion mit pIII.

Vektorengineering: Von Wildtyp zu effizienten Anzeige-Systemen

1. Vektoränderungsstrategien

• Wildtyp-Gen-Deletion: Teilweise oder vollständige Löschung des nativen gIII-Gens (z. B. gIIIΔ1-406 in pCOMB3-Vektoren) zwingt zur Anzeige von fremden Proteinen, die an das modifizierte pIII fusioniert sind.
• Hybrid-Capsid-Strategie (pVIII-Darstellung): Die Beibehaltung eines Teils des Wildtyp-gVIII ist notwendig, um die Stabilität des Capsids zu gewährleisten, wenn exogene Peptide auf pVIII dargestellt werden.
• Phagemid-System:
  • Struktur: Kombiniert ein Plasmid-Rückgrat (Replikationsursprung, Antibiotikaresistenz) mit dem M13-Replikationsursprung (f1 ori) und einem Genfragment für ein Display-Protein (z. B. verkürztes gIII).
  • Vorteile: Vereinfacht den Aufbau von Bibliotheken im Vergleich zu vollständigen Phagen-Genomen und verbessert erheblich die Transformationsrate (ermöglicht Bibliothekskapazitäten von bis zu 10¹¹).
  • Vertretervektoren: pCOMB3 (Antikörperanzeige), pSEX (Peptidanzeige), pDISPLAY-BAC (Großfragmentanzeige).

2. Kritische Rolle der Helfer-Phagen

Ingenieurmäßig hergestellte Helferphagen (z. B. M13KO7, HyperPhage) sind entscheidend für die Vermehrung von Phagemiden:

• Genommodifikationen: Enthalten einen zusätzlichen Plasmidursprung (z. B. p15A ori) und ein Antibiotikaresistenzgen (z. B. Kanamycin).
• Funktionaler Defekt: Tragen eine bernsteinfarbene Mutation in ihrem eigenen gIII-Gen, was die Vermehrung in Suppressor (supE)-Stämmen erforderlich macht. Dies gewährleistet eine bevorzugte Verpackung der Phagemid-DNA, die die fremde pIII-Fusion kodiert.
• Superinfektionsprozess:
  • E. coli, die den Phagemid-Vektor tragen, werden mit dem Helfer-Phagen infiziert.
  • Helfer-Phagenproteine erleichtern die Replikation von Phagemid-ssDNA.
  • Neu synthetisierte Phagemid-ssDNA wird mit Hilfe von strukturellen Proteinen des Helferphagen verpackt.
  • Rekombinante Phagenpartikel, die das fremde Protein anzeigen, werden freigesetzt.

Prozessoptimierung des Bibliotheksbaus

1. Techniken zur Einfügung von Fremdfragmenten

• Restriktionsklonierung: Verwendet seltene Restriktionsstellen (z. B. SfiI, NotI), um die Selbstligatur des Vektors zu minimieren.
• Nahtloses Klonen (z. B. Gibson-Assembly, Golden-Gate): Erhöht die Effizienz beim Einfügen großer Fragmente (bis zu ~3 kb).
• Kodonsoptimierung: Entscheidend für von Säugetieren abgeleitete Gene, um Expressionsprobleme zu vermeiden, die durch seltene Kodons in E. coli verursacht werden.

2. Sicherstellung der Kapazität und Vielfalt der Bibliothek

• Elektrotransformation: Nutzt Hochspannungspulse (>1,8 kV), um rekombinante DNA in elektrokompetente E. coli einzuführen, und erreicht hohe Effizienzen (~10¹⁰ CFU/µg DNA).
• Vielfalt Kontrolle:
  • Minimieren Sie PCR-Bias: Verwenden Sie hochfidele Polymerasen (z. B. Phusion) und begrenzen Sie die PCR-Amplifikationszyklen (<20 Zyklen).
  • Mehrstufiges Screening: Führen Sie mehrere Runden der Infektion und Expansion durch, um Verzerrungen durch schnell wachsende Klone zu mindern.

Innovation in Screening-Strategien

1. Lösung-Phasen-Panning

• Vorteil: Reduziert unspezifische Bindungen, die mit der Festphasenimmobilisierung verbunden sind.
• Protokoll:
  • Inkubieren Sie die Phagenbibliothek mit biotiniliertem Ziel in Lösung.
  • Fangen Sie Phagen-Ziel-Komplexe mit streptavidin-beschichteten Perlen ein.
  • Eluieren Sie gebundene Phagen mit niedrigem pH-Wert (z. B. Glycin-HCl, pH 2,2) oder durch wettbewerbliche Verdrängung mit löslichem Ziel.

2. In Vivo Selektion

• Anwendung: Zielt auf gewebespezifische Rezeptoren (z. B. Tumorvaskularisierungsmarker).
• Protokoll: Injektion der Phagenbibliothek in ein Tiermodell; Rückgewinnung von Phagenpartikeln, die spezifisch an das Zielgewebe gebunden sind.

3. Mikrofluidisches Screening

• Chip-Design: Integriert Module zur Zielimmobilisierung, präzisen Fluidkontrolle und Phagenfang.
• Vorteile: Reduziert den Probenverbrauch drastisch und erhöht die Durchsatzrate beim Screening (potenziell um das 1000-Fache im Vergleich zu herkömmlichen Methoden).

Bibliotheksqualitätsbewertungssystem

1. Wichtige Qualitätskontrollparameter

• Bibliothekskapazität: Muss mehr als 10⁹ unabhängige Klone überschreiten (bestimmt durch Verdünnungsplattierung).
• Einschubrate: Sollte >95% betragen (verifiziert durch Kolonie-PCR oder Sequenzierung).
• Vielfalt: Quantifiziert durch den Shannon-Index >8 (bestimmt durch NGS-Tiefensequenzierung).
• Leerer Vektoranteil: Muss <1% sein (bewertet durch PCR, die auf die gIII-Deletion abzielt).

2. Funktionale Verifikation

• Bindungsaktivität: Bewertet mit ELISA (monoklonaler Phagen) oder Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) zur Affinitätsmessung.
• Anzeigeneffizienz:
  • Western Blot: Bestätigt die Expression des fremden Protein-pIII/pVIII-Fusionsproteins.
  • Immunoelektronenmikroskopie: Visualisiert direkt die Dichte der auf der Phagenoberfläche angezeigten Proteine.

Grenzenlose Fortschritte und Herausforderungen

1. Unnatürliche Aminosäure-Inkorporation

Nutzt orthogonale tRNA/Synthetase-Systeme, um bioorthogonale chemische Griffe (z. B. Azidohomoalanin) in präsentierte Proteine einzuführen, was eine kovalente Zielerfassung über Click-Chemie ermöglicht.

2. Kopplung der Anzeige mit gerichteter Evolution

Integriert Gene, die mutagene Enzyme kodieren (z. B. fehleranfällige T7-RNA-Polymerase), in das Phagen-Genom und schafft einen kontinuierlichen Zyklus aus Anzeige, Mutation und Screening.

3. Zentrale Herausforderungen und Strategien zur Minderung

• Großes Protein-Display-Engpass: Behoben durch die Entwicklung von Dual-Display-Systemen (z.B. kooperatives pVIII/pIII-Display).
• Wirtstoxizität: Gemindert durch den Einsatz von streng regulierten induzierbaren Promotoren (z.B. arabinose-induzierbarer P_BAD), um die Expression toxischer fremder Proteine zu steuern.

Evolution der Sequenzierungstechnologie: Erfassung des M13-Genomplans

Sanger-SequenzierungDie Goldstandard-Stiftung

Die Sanger-Sequenzierung dient als traditioneller, hochgenauer Maßstab für die genetische Analyse. Ihre Anwendung in M13-Phagenbibliotheken konzentriert sich auf die Überprüfung rekombinanter Klone, insbesondere auf die Bestätigung der Richtigkeit und Vollständigkeit eingefügter fremder Sequenzen.

Gezielte Verifizierungsansatz

Die anfängliche Bibliotheksvalidierung verwendet spezifische Primer zur Sequenzierung einzelner rekombinanter Klone:

• Vorwärtsprimer: Zielphagen-Sequenzen (z. B. -96gIII, die an das M13 gIII-Gen anlagern).
• Reverse-Primer: Verwenden Sie universelle Sequenzen (z. B. pUC/M13), um über eingefügtes fremdes DNA zu sequenzieren.

Monoklonale Validierungsanwendung

Dieses Verfahren zeichnet sich durch eine sorgfältige Überprüfung exogener Sequenzinsertationen auf der Ebene einzelner Klone aus. Obwohl es relativ wenig durchsatzstark und zeitaufwendig ist, bleiben die langen Leselängen (>800 bp) vorteilhaft, um vollständige Insertionssequenzen genau zu charakterisieren.

Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS): Ermöglichung der panoramischen Analyse

Wesentliche Schritte zur Bibliotheksvorbereitung

Die Vorbereitung von M13-Bibliotheken für NGS umfasst typischerweise:

• Extraktion von rekombinantem Phagen-Einzelstrang-DNA (ssDNA), die direkt als Eingabe für verschiedene Bibliotheksvorbereitungsstrategien dient und dabei die Vielfalt bewahrt.
• Alternativ kann die Verwendung von doppelsträngiger replikativer Form (RF) DNA als Ausgangspunkt erfolgen, insbesondere für Analysen, die einen breiteren genomischen Kontext erfordern.

Entscheidend ist, dass strenge Protokolle eine Kontamination mit Wildtyp-Phagen-DNA verhindern, um die Zuverlässigkeit der Daten zu gewährleisten.

Plattformauswahlstrategie

• Illumina (Short-Read): Dominierend aufgrund von Kosten-Effektivität, hoher Durchsatz und Genauigkeit (>Q30). Es ist ideal für die Qualitätskontrolle großer Bibliotheken (Kapazitätsbewertung, Diversitätsanalyse) und zur Verfolgung der klonalen Populationsanreicherung nach dem Screening. Allerdings stellt die inhärente kurze Leselänge Herausforderungen bei der Assemblierung von langen Inserts oder repetitiven Regionen dar.
• PacBio SMRT & Oxford Nanopore (Langzeit-Lesen): Erzeugen Sie außergewöhnlich lange Lesungen (im kb- bis Mb-Bereich), die es ermöglichen, gesamte Einspeisungen sowie flankierende Regionen abzudecken. Diese Fähigkeit vereinfacht die Datenanalyse erheblich und verbessert signifikant die Erfassung vollständiger Fusionsgen-Sequenzen. Bemerkenswert ist, dass die Oxford Nanopore-Plattform native ssDNA direkt sequenziert, ein entscheidender Vorteil für M13-Phagenbibliotheken.

Vorteile von Long-Read-Plattformen

• PacBio SMRT: Lange Reads ermöglichen eine präzise Charakterisierung über erweiterte Sequenzen, Wiederholungen und strukturelle Variationen hinweg und bieten eine überlegene Genauigkeit für komplexe Genfusionen.
• Oxford Nanopore: Direkte ssDNA-Sequenzierung umgeht PCR-Artefakte. In Kombination mit hoher Durchsatzrate, extremen Lese-längen und betrieblicher Einfachheit ist Nanopore wertvoll für die eingehende Analyse vielfältiger Bibliotheken und schnelle Anwendungen im Feld, obwohl eine spezifische bioinformatische Verarbeitung für höhere Rohfehlerquoten erforderlich ist.

Synergie: Integration von Sanger- und NGS-Technologien

Sanger-Sequenzierung und NGS werden häufig synergistisch eingesetzt. Die präzise Genauigkeit der Sanger-Methode validiert spezifische Sequenzen in kleineren Bibliotheken oder kritischen Klonen. NGS ermöglicht das Screening großer Bibliotheken, funktionale Analysen und umfassende genomische Charakterisierungen.

• Integriertes Workflow-Beispiel:
  • Die initiale panoramische NGS-Analyse liefert massive Datensätze für die umfassende Bewertung der Bibliothek.
  • Die Sanger-Sequenzierung validiert wichtige Klone, die während des Screenings identifiziert wurden.
  • Gezielte NGS analysiert angereicherte Pools nach dem Panning.
  • Die Sanger-Sequenzierung bestätigt weiter die Vollständigkeit und Genauigkeit wichtiger Insertionssequenzen.

Kern-Datenanalyse: Rohdaten in biologische Erkenntnisse umwandeln

Effiziente und dennoch rigorose Datenverarbeitung ist entscheidend, um sinnvolle biologische Interpretationen abzuleiten:

1. Datenvorverarbeitung & Qualitätskontrolle

• Reinigung: Entfernen Sie Adapter und minderwertige Basen mit Werkzeugen wie Fastp oder Trimmomatic.
• Qualitätsbewertung: Bewerten Sie Q-Scores, GC-Gehalt, Verteilung der Sequenzlängen und erkennen Sie potenzielle systematische Fehler oder Kontaminationen mit FASTQC.

2. Sequenzanpassung und -zusammenstellung

• Referenzbasierte Ausrichtung: Kartenlesungen präzise auf die modifizierte M13-Vektorreferenz (ohne Wildtyp-Zielgenabschnitte) unter Verwendung von Bowtie2 oder BWA. Dies unterscheidet das Vektor-Rückgrat von exogenen Einspeisungen. Visualisieren Sie die Integrität der Ausrichtung mit Tools wie IGV.
• De Novo Assembly: Verwenden Sie Spades oder Megahit für große Inserts oder neuartige Sequenzen. Mildern Sie Assemblierungsfehler in repetitiven M13-Regionen (z. B. intergenische Spacer) durch:
  • Identifizierung von Tandemwiederholungen mit Tandem Repeat Finder (TRF).
  • Korrigieren von Insertion-Vektor-Chimären mithilfe von Scaffold-Modulen wie MetaSPAdes.

3. Insertion Sequenzauflösung: Dekodierungsfunktion

• Extraktion: Präzise Isolierung exogener Sequenzen zwischen definierten flankierenden Koordinaten, die während der Ausrichtung identifiziert wurden.
• Übersetzung und Annotation: DNA-Sequenzen in Aminosäuresequenzen umwandeln. Funktionale Domänen und Stellen mithilfe der BLASTP-, InterProScan- und Pfam-Datenbanken vorhersagen.

4. Analysetools für Schlüsselanwendungen

• Domänenvorhersage: Identifizieren Sie kritische Regionen (z. B. Antikörper-CDRs, aktive Stellen von Enzymen) mit HMMER und Pfam-A.
• Struktur-Simulation: Vorhersage konformationeller Veränderungen in angezeigten Peptiden/Proteinen mithilfe von AlphaFold2 oder RoseTTAFold.
• Affinitäts-Evolutionsanalyse: Erkennung positiver Selektionsstellen in angereicherten Klonen nach dem Panning durch dN/dS-Berechnungen (CODEML/PAML).
• Diversitätsbewertung: Quantifizierung der Sequenzkomplexität, klonalen Verteilung und Häufigkeitsverschiebungen innerhalb von Bibliotheken, die entscheidend für die Identifizierung von hochpotenziellen Klonen nach dem Screening sind.

5. Vektorintegrität und Variantenuntersuchung

• Strukturelle Variation: Bestätigen Sie beabsichtigte Deletionen (z. B. gIIIΔ1-406 in pCOMB3), indem Sie eine Nullabdeckung in den Zielregionen bestätigen.
• Replikationsursprungskontrolle: Erkennung von Verpackungsfehlern durch plötzliche Abdeckungsabfälle am f1-Ursprung.
• Abdeckungsanalyse: Identifizieren Sie unbeabsichtigte Deletionen (z. B. verbleibende Wildtyp-Fragmente) und schließen Sie Vektormutationen/-trunkierungen aus.
• Chimären-Screening: Erkennung von falsch zusammengesetzten Vektorstücken, die innerhalb einzelner Phagenpartikel co-verpackt sind.

6. Biologische Auswirkungen der Chimerismus-Detektion

• Trunkiertes Display-Proteine: Identifizieren Sie Vektor-Insertion-Rekombinanten, die Trunkierungen verursachen, unter Verwendung strenger Blastn-Ausrichtungsgrenzen (z. B. Abdeckungsgrad der Abfrage <80%).
• Polykonale Co-Verpackung: Screening auf falsch-positive Ergebnisse mit PacBio HiFi-Lesungen, die doppelte Insertionen in einzelnen Partikeln nachweisen.

7. Konvergenz von Spitzentechnologien

(1) Maschinelles Lernen zur Funktionsvorhersage

Trainiere bidirektionale LSTM-Modelle, um die Bindungswahrscheinlichkeiten von Peptiden basierend auf Sequenzdaten vorherzusagen. Beispielarchitektur:

• eine Sequenz von 15 Aminosäuren (ganzzahliger Code)
• Verarbeitungsfluss:
  • Aminosäure-ID → hochdimensionale Vektorrepräsentation (Embedding-Schicht)
  • Bidirektionale Lernsequenzmerkmale (LSTM erfasst Kontextabhängigkeiten)
  • einzelner Wahrscheinlichkeitswert (durch Sigmoid in Wahrscheinlichkeit umgewandelt)

(2) Einzel-Phagen-Resolutionsanalyse

Nutzen Sie die Mikrofuidik von 10x Genomics: Kapseln Sie einzelne Phagenpartikel in Tropfen ein und analysieren Sie monoklonale Sequenzen mit den Cell Ranger-Pipelines.

(3) Dynamische Evolutionsverfolgung

Rekonstruieren Sie klonale phylogenetische Bäume (unter Verwendung von PhyloPhlAn), um die Evolution der Linien über die Screening-Runden hinweg nachzuvollziehen.

Kernanwendungsszenario: datengetriebene Entdeckungsmaschine

Konstruiertes Phagen-System zur Bekämpfung resistenter Krankheitserreger

Um schwer zu behandelnde übertragbare Krankheitserreger zu bekämpfen, haben wir das M13-Bakteriophagen als Transportmittel für zwei funktionelle Peptide entwickelt:

• RGD-Peptid: Verbessert die zelluläre Aufnahme.
• Pathogen-abgeleiteter Membranpeptid (PMPD): Ein Fragment des Membranproteins von Chlamydia trachomatis (CT), das entwickelt wurde, um eine Infektion zu blockieren.

Wesentliche experimentelle Ergebnisse

Der modifizierte Phage durchdringt erfolgreich zelluläre Barrieren und erhält Zugang zu den Einschlusskörperchen, in denen CT intrazellulär lokalisiert ist. Diese gezielte Lieferung reduziert die CT-Infektionsraten in zervikalen Zellmodellen erheblich.

Mechanistische Einsicht

Die beobachtete anti-infektiöse Aktivität ist entscheidend von dem PMPD-Peptid abhängig. Wichtig ist, dass dieser schützende Effekt nicht mit herkömmlichen Antikörpern reproduziert werden kann.

Bedeutung und breitere Anwendung

Diese Arbeit etabliert eine neuartige Strategie zur gezielten Durchdringung von Schleimhautoberflächen und Biofilmen. Die phagenbasierte Plattform bietet vielversprechende Möglichkeiten zur Anpassung gegen andere herausfordernde sexuell übertragbare Erreger, einschließlich HIV (Bhattarai SR et al., 2012).

AD-Intervention und -Überwachung

1. Kernfunktionalität: Zielgerichtetes Erkennungstool

Dieses System verwendet speziell entwickelte Peptide (z. B. AB30-39), die für die direkte Bindung an kleine Aβ-Oligomere konzipiert sind. Diese löslichen Oligomere dienen als frühe Marker für die Alzheimer-Krankheit (AD), sind jedoch notorisch schwer innerhalb des Gehirngewebes mit herkömmlichen Nachweismethoden zu erfassen.

Durchbruchfähigkeiten

• Früherkennung: Das Werkzeug identifiziert Aβ-Agregate im Hippocampus transgener Mäuse in Stadien, die der Plaquebildung vorausgehen.
• Anwendung von menschlichem Gewebe: Es stellt die erste erfolgreiche Erkennung spezifischer Aβ-homo-oligomerer Strukturen in postmortalen Gehirngewebeproben von AD-Patienten dar.

Diagnoseerweiterung

Aktuelle Forschungen nutzen diese Plattform, um potenzielle Korrelationen zwischen quantifizierten Aβ-Oligomerwerten und dem Fortschreiten des kognitiven Rückgangs bei AD zu untersuchen.

Therapeutische Erkundung

Die Nutzung der inhärenten Fähigkeit des Werkzeugs, die Blut-Hirn-Schranke zu durchdringen, sowie seiner geringen Immunogenität, führt zur Entwicklung von in vivo gezielten Therapien. Besonders das Peptid AB30-39 zeigt eine überlegene Wirksamkeit bei der Hemmung der Aβ-Aggregation im Vergleich zu AB33-42 und hebt damit sein therapeutisches Potenzial hervor (Azeredo J et al., 2024).

Direkte Genotyp-Phänotyp-Assoziation

Vektor Konstruktion

Genomische oder metagenomische DNA-Proben wurden fragmentiert und anschließend in das M13-Phagenvektor-Backbone kloniert.

Protein-Display-Mechanismus

DNA-Fragmente innerhalb des Vektors steuern die Expression entsprechender Proteinfragmente. Diese Peptide werden auf der Phagenoberfläche angezeigt, während ihre kodierenden Genfragmente zusammen mit dem Phagenpartikel verpackt sind.

ORF-Anreicherungsmechanismus

Ein pIII-defizienter Helferphage (M13KO7ΔPIII) ermöglicht die selektive Vermehrung von Klonen, die vollständige Open Reading Frames (ORFs) enthalten (Heine PA et al., 2023).

Entdeckung von Impfstoffzielen: Technische Strategie

Eine Oligopeptidbibliothek, die aus mRNA der Speicheldrüse von Zecken (18 Stunden nach dem Nymphenfressen gesammelt) abgeleitet wurde, wurde für das Phagen-Display-Screening erstellt. Methodisch war diese Studie wegweisend, da sie menschliches Immuns serum als Screening-Probe verwendete – im Gegensatz zu tierischen Seren – um authentische menschliche Immunantworten besser nachzubilden. Kandidatziele wurden durch rekombinante Proteinexpression und ELISA validiert.

Wichtigste Ergebnisse: Charakterisierung des Zielproteins

• Metalloproteinase MP1:
  • Zeigt eine starke Immunogenität, belegt durch Hyperreaktivität gegenüber menschlichen Serumantikörpern (bestätigt frühere Hypothesen aus der Literatur).
  • Zeigt eine hohe Sequenzkonservierung (84% Homologie) mit den Orthologen von Ixodes pacificus und Ixodes ricinus.
  • Zeigt erhebliches Impfpotenzial: Tierstudien bestätigten eine Überlebensreduktion bei Zecken, die mit seinem homologen Protein herausgefordert wurden.
• Dabigatran:
  • Die Immunogenität konnte aufgrund eines Fehlers bei der rekombinanten Expression nicht bestätigt werden.
  • Funktionell beteiligt an der Störung der Hämostase des Wirts und der entzündlichen Reaktionen.
  • Intrazelluläre Proteine: Enthüllen einen neuartigen Mechanismus: Der Austritt nach dem Zelltod kann lokale Entzündungen hervorrufen, die potenziell die immununterdrückenden Taktiken von Zecken entgegenwirken.

Kern Durchbrüche

• MP1s vielseitiger Wert:
  • Artenübergreifendes Potenzial: Der Schutz wichtiger Zeckenvektoren ermöglicht eine breite Zielsetzung, insbesondere funktionaler Domänen (zinkbindende und cysteinreiche Regionen).
  • Doppelmechanismus: Die Bindung von Antikörpern hemmt die enzymatische Funktion, stört gleichzeitig das Blutsaugen und blockiert die Übertragung von Krankheitserregern.
• Methodologische Innovation: Die auf menschlichem Serum basierende Screening-Methode identifizierte erstmals menschenspezifische Zeckenepitoppe und informierte direkt das Impfdesign (Becker M et al., 2015).

Für weitere Informationen darüber, was Phagen-Sequenzierung ist, siehe "Was ist Phagen-Sequenzierung? Ein vollständiger Leitfaden für Forscher".

Es sind weitere NGS-Sequenzierungsmethoden für Phagen verfügbar.Next-Generation-Sequenzierung zur Phagenanalyse: Ein moderner Ansatz.

Die Leute fragen auch

Warum ist das Bakteriophage M13 als Sequenzierungsvektor nützlich?

M13 ist der Vektor der Wahl für die Dideoxy-Sequenzierung aus zwei Hauptgründen. Erstens werden M13-Bakteriophagen in Einzelsträngen von DNA verpackt, die aus infizierten Escherichia coli-Zellen in das umgebende Kulturmedium extrudiert werden.

M13 ist lysogen.

Darüber hinaus hat sich das M13-Phagen-System als ein sicheres und stabiles Verfahren erwiesen, dank seiner lysogenen Eigenschaften und der robusten Struktur.

Was sind die Vorteile des M13-Vektors?

Der Hauptvorteil der Verwendung von M13 für das Klonen besteht darin, dass die von infizierten Zellen freigesetzten Phagenpartikel einzelsträngige DNA enthalten, die homolog zu nur einem der beiden komplementären Stränge der geklonten DNA ist, und daher als Vorlage für die DNA-Sequenzanalyse verwendet werden kann.

Was ist der Unterschied zwischen Lambda-Phagen und M13-Phagen?

λ-Phage ist ein temperenter Phage, der E. coli infiziert und ein doppelsträngiges lineares DNA-Genom hat. Sein Genom ist in Regionen organisiert, die Proteine für den Phagenkopf, den Schwanz und die Funktionen der Lysogenie/Lyse kodieren. M13 ist ein filamentöser Phage mit einem einzelsträngigen zirkulären Genom.

Referenzen:

1. Moon JS, Choi EJ, Jeong NN, Sohn JR, Han DW, Oh JW. "Forschungsfortschritte bei M13-Bakteriophagen-basierten Biosensoren." Nanomaterialien (Basel)2019, 11. Okt;9(10):1448. doi: 10.3390/nano9101448
2. Wang R, Li HD, Cao Y, Wang ZY, Yang T, Wang JH. "M13-Phage: ein vielseitiges Bauelement für eine hochspezifische Analyseplattform." Anal Bioanal Chem. 2023 Jul;415(18):3927-3944. doi: 10.1007/s00216-023-04606-w
3. Allen GL, Grahn AK, Kourentzi K, Willson RC, Waldrop S, Guo J, Kay BK. "Erweiterung der chemischen Diversität von M13-Bakteriophagen." Front Microbiol2022, 8. August; 13:961093. doi: 10.3389/fmicb.2022.961093
4. Bhattarai SR, Yoo SY, Lee SW, Dean D. "Ingenieurtechnisch entwickelte phagenbasierte therapeutische Materialien hemmen die intrazelluläre Infektion mit Chlamydia trachomatis." Biomaterialien. 2012 Jul;33(20):5166-74. doi: 10.1016/j.biomaterials.2012.03.054
5. Martins IM, Lima A, de Graaff W, Cristóvão JS, Brosens N, Aronica E, Kluskens LD, Gomes CM, Azeredo J, Kessels HW. "M13-Phagen, die mit Peptidmotive modifiziert sind, als Werkzeug zur Detektion von Amyloid-β-Oligomeren im Gehirngewebe." Commun Biol2024 Jan 27;7(1):134. doi: 10.1038/s42003-024-05806-5
6. Heine PA, Ballmann R, Thevarajah P, Russo G, Moreira GMSG, Hust M. "Entdeckung von Biomarkern durch ORFeome Phagenanzeige." Methoden der Molekularbiologie. 2023;2702:543-561. doi: 10.1007/978-1-0716-3381-6_27
7. Becker M, Felsberger A, Frenzel A, Shattuck WM, Dyer M, Kügler J, Zantow J, Mather TN, Hust M. "Anwendung der M13-Phagenanzeige zur Identifizierung immunogener Proteine aus dem Speichel von Zecken (Ixodes scapularis)." BMC Biotechnologie2015, 30. Mai; 15:43. doi: 10.1186/s12896-015-0167-3