Next-Generation-Sequenzierung zur Phagenanalyse: Ein moderner Ansatz

Bakteriophagen – die häufigsten biologischen Entitäten der Erde – üben einen grundlegenden Einfluss auf die mikrobielle Ökologie, die bakterielle Evolution und die menschliche Gesundheit aus, einschließlich therapeutischer Anwendungen. Ihre außergewöhnliche genetische Vielfalt und komplexen Lebenszyklen stellen jedoch erhebliche Herausforderungen für konventionelle Forschungsmethoden dar. Next-Generation-Sequenzierung (NGS) Technologien treiben jetzt revolutionäre Fortschritte in Phagenforschung, was eine umfassende Analyse dieses genetisch unterexplorierten "dunklen Materials" ermöglicht.

I. Einschränkungen der Phagenforschung vor der NGS

Vor der nächsten Generation von Sequenzierungen (NGS) standen Phagenstudien vor erheblichen methodologischen Einschränkungen aufgrund der Abhängigkeit von herkömmlichen Techniken:

• Kulturabhängige Entdeckung: Die Isolierung neuartiger Phagen erforderte die sichtbare Plaquebildung auf spezifischen bakteriellen Wirten, wodurch unculturierbare virale Populationen als unzugängliche "dunkle Materie" blieben.
• Unzureichende Sequenzierungskapazität: Die niedrige Durchsatzrate der Sanger-Sequenzierung erlaubte die Analyse von nur einer begrenzten Anzahl an Phagenklonen pro Durchgang. Dieser Ansatz erwies sich als äußerst ressourcenintensiv und war nicht in der Lage, die Diversität auf Populationsebene zu erfassen.
• Metagenomische Analyseengpässe: Traditionelle molekulare Methoden (z. B. DGGE, RFLP) hatten nicht die erforderliche Auflösung, um komplexe Phagengemeinschaften in Umweltsamples (Darmmikrobiota, Boden, marine Ökosysteme) zu charakterisieren, wodurch es nicht gelang, umfassende genomische Profile zu rekonstruieren.
• Oberflächliche Diversitätsbewertung: Die Klassifizierung basierend auf der Plaque-Morphologie und dem Wirtsspektrum lieferte nur minimale Einblicke in tiefe evolutionäre Beziehungen oder globale Verteilungsmuster unter Phagenlinien.

Ⅱ. NGS-Empowerment: Revolutionierung der Phagenforschung durch Hochdurchsatztechnologien

Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat sich als transformative Biotechnologie etabliert, die die Phagenforschung durch beispiellose Durchsatzraten, Empfindlichkeit und Kosteneffizienz beschleunigt. Durch die Ermöglichung umfassender genomischer Analysen bildet NGS die Grundlage für wichtige Anwendungen in der Umweltvirologie und der therapeutischen Entwicklung.

1. Einzel-Phagenomische Sequenzierung

• Technischer Arbeitsablauf:
  • Virenpartikel durch Zentrifugation/Filtration reinigen
  • Viren-Nukleinsäure (hauptsächlich DNA) extrahieren
  • Konstruktion von NGS-kompatiblen Bibliotheken
  • Führen Sie Hochdurchsatz-Sequenzierung durch.
  • Führen Sie eine de novo-Assemblierung oder eine referenzbasierte Annotation durch.
• Auswahl der Sequenzierungsplattform:
  • Kurzlese (Illumina): Kosteneffiziente hohe Genauigkeit (Q30 > 99,9 %), ideal für die schnelle Assemblierung bekannter Phagen (z. B. Aufklärung von SARS-CoV-2-Resistenzmutationen)
  • Long-Read (PacBio/Nanopore): Löst Herausforderungen bei repetitiven Sequenzen (z. B. Schwanzgencluster), ermöglicht vollständige zirkuläre Genome (z. B. ΦX174 5,3 kb-Genom über einen einzelnen Nanopore-Lauf)
• Assemblierungsoptimierung:
  • Hybride Assemblierung: Vereint die Genauigkeit von Kurzlesungen mit der Kontinuität von Langlesungen (SPAdes-Unicycler-Pipeline)
  • Telomererfassung: Terminaltransferase-vermittelte Aptameraddition verhindert den Verlust von linearen Genomenden (z. B. Phage T7)
• Wissenschaftlicher Wert:
  • Schnelle Genomakquisition (Tage vs. Monate mit Sanger-Sequenzierung)
  • Umfassende strukturelle Annotation einschließlich kodierender Sequenzen und regulatorischer Elemente
  • Identifizierung funktioneller Gene, die die Wirtserkennung, Lyse und Lysogenie steuern
  • Präzise phylogenetische Klassifikation und evolutionäre Analyse
  • Grundlage für personalisierte Phagentherapie durch Virulenz- und Wirtsspektrum-Profilierung
• Funktionale Bergbau-Fortschritte:
  • Vergleichende Genomik: Das PhageGCN2-Modell ermöglicht die Vorhersage von Wirtsspezies über Arten hinweg (>85% Genauigkeit durch Gen-Sharing-Netzwerke)
  • Synthetische Biologie:
    • Genomstreamlining: Löschung nicht essenzieller Bereiche (z. B. 30% Reduktion bei E. coli T3 Phagen behält Infektiosität)
    • Geleitete Evolution: NGS-geführte Auswahl von thermalen/spektrumanpassenden Mutanten (z.B. konstruiertes PP7 gegen P. aeruginosa)

Phagenbibliothek Tiefensequenzierungsplattform (Soluri MF et al., 2018)

2. Umwelt Phagen-Metagenomik (Viromik)

• Technischer Arbeitsablauf:
  • Umweltproben sammeln (Fäkalien, Wasser, Boden)
  • Bereichern Sie virale Partikel durch physikochemische Methoden.
  • Entfernen von zellulärem Material/DNase durch Filtration/enzymatische Behandlung
  • Extrahieren und amplifizieren von viralen Nukleinsäuren
  • Konstruktion metagenomischer Bibliotheken für NGS
  • Gemeindedaten sammeln und annotieren
• Probenbearbeitung:
  • Eisenflockung (FeCl₃): >80% virale Rückgewinnung aus Wasser, Eliminierung der Abhängigkeit von Ultrazentrifugation
  • Kontaminantenentfernung: Duale DNase + PMA-Behandlung hemmt freie/tote Zell-DNA
  • Kontrolle der Wirtskontamination: Taxator-tk quantifiziert restliches 16S rRNA (<5% Schwellenwert)
• Bioinformatische Innovationen:
  • MetaViralSPAdes: Virus-spezifische Contig-Identifizierung
  • VAMB-Binning: Sequenzzusammensetzung + Abdeckungsanalyse verdoppelt die Vollständigkeit makroviraler Contigs.
• Kernbeiträge:
  • Kulturunabhängige Profilierung: Zugriff auf unkultivierbare Phagen-Wirt-Systeme
  • Gemeinschaftsdynamik: Quantifiziert strukturelle Veränderungen in verschiedenen Umgebungen (z. B. erkrankter Darm vs. Abwasser)
  • Taxonomische Erweiterung: Entdeckung neuer viraler Linien (neue Ordnungen/Familien)
    • Host-Interaktionsmapping:
      • CRISPR-Spacer-Analyse sagt Phagen-Wirt-Verknüpfungen voraus (z. B. marine SAR11-Phagen)
      • Maschinelles Lernen zur Vorhersage von Wirten (WISH: Boden-Aktinobakteriophagen; VHULK: Darmphagen-Bacteroidetes)
    • Beweise für Koevolution:
      • Echtzeit-Tracking des "Wettrüstens" über die Dynamik von Phagen-CRISPR-Wirt-Arrays (z. B. Synechococcus-Phage S-RSM4)
      • Horizontaler Gentransfer von ARGs/Virulenzfaktoren (z. B. exoT im P. aeruginosa Phagen Gifsy-2)

3. Gastgeber Transkriptomik für Phagen-Wirt-Dynamik

• Technischer Arbeitsablauf:
  • Ernten Sie infizierte Wirtszellen zu definierten Infektionszeitpunkten.
  • Gesamt-RNA extrahieren
  • Bereiten Sie strand-spezifische Bibliotheken vor.
  • Führen Sie RNA-Sequenzierung (RNA-seq) durch.
  • Analysiere differentielle Genexpression
• Methodologische Verfeinerung:
  • Temporale Auflösung: 2-5 Minuten Abtastung erfasst lyse Übergänge (z. B. T4 Phagen-Promotorwechsel)
  • Strangspezifische Bibliotheken: Löst die Antisense-Regulation (z.B. Streptomyces ΦC31 Phage)
• Wichtige Erkenntnisse:
  • Infektionschoreografie: Transkriptionale Dynamik während der Lyse (Übernahme der Wirtsmaschinerie) und Lysogenie (Integration/Dormanzprogrammierung)
  • Regulatorische Knoten: Master-Phagenregulatoren, die den Beginn der Lyse und die Unterdrückung der Wirtsabwehr steuern
  • Abwehrmechanismen: Angeborene (RM/DIS-Systeme) und adaptive (CRISPR-Cas) Immunaktivierung
    • 8-fache Cas9-Hochregulation nach Infektion (S. pyogenes)
    • Prokaryotische Argonaute-vermittelte mRNA-Spaltung (T. thermophilus Pago)
  • Integrative Ansätze:
    • Dual-RNA-Seq: Gleichzeitige Quantifizierung von Wirt-Phagen-Transkripten (z. B. inhibiert der Salmonellenphage SPN3US die SOS-Reparatur, während er die virale DNA-Polymerase aktiviert)

4. Einzelzell- und Einzelvirus-Genomik

• Spitzenplattformen:
  • Einzelzell-Analyse:
    • Tropfen-Mikrofluidik: 99,7% Auflösung der Infektionsschicksale (z.B. Entscheidungen über die Lyse/Lysogenie von B. subtilis SPβ Phagen)
    • Visium räumliche Transkriptomik: Kartierung von Phagen-Expressions-Hotspots (z. B. M. tuberculosis-Phagen in Granulomen)
  • Einzel-Virion-Sequenzierung:
    • Nanopore-Direkt-RNA-Sequenzierung: 0,1 fg Sensitivität erkennt mRNA-Verpackungsheterogenität (z. B. MS2-Phage)
    • Echtzeit-Infektionsverfolgung: Überwacht Adsorptions-zu-Freisetzungszyklen
  • Wissenschaftliche Auswirkung:
    • Infektionsschicksalsbestimmung: Lysogenie-Wahrscheinlichkeit im Zusammenhang mit CI/CRO-Expressionsverhältnissen im λ-Phagen
    • Widerstands-Evolution: Einzelzell-Mutationsprofilierung sagt Widerstandswege voraus (z.B. Acinetobacter-Phage AbTNL)
  • Konvergente Methoden:

Zukünftige Richtungen & Fazit

• Aufkommende Grenzen:
  • KI-Integration: AlphaFold3 sagt Schnittstellen zwischen Schwanzfaser und Rezeptor für die Wirtsbereichs-Engineering voraus
  • In-situ-Überwachung: In Fermenter implantierte Nanopore-Geräte zur Echtzeit-Phagenüberwachung
  • Globale Initiativen: Earth Virome Projekt, das über 10⁷ Proben für die Modellierung des Phagen-Ökosystems zusammenstellt
• Fazit: NGS hat sich von einem Sequenzierungswerkzeug zu einem holografischen Forschungsparadigma entwickelt:
  • Breite: >100.000 neuartige Phagen-Genome/Jahr (ICTV 2023)
  • Tiefe: Einzelmolekülauflösung der Infektionsheterogenität
  • Phase-II-Studien mit gentechnisch veränderten Phagen (z. B. CRISPR-Cas3-verbesserte Phagen von Locus Biosciences)

Mit der fortschreitenden Genauigkeit von Langlese-Tests (Q50+) und der Durchsatzfähigkeit von Einzelzellen wird die nächste Generation der NGS die Phagenbiologie weiter entschlüsseln und die biomedizinische/ökologische Ingenieurwissenschaft transformieren.

Ⅲ. Herausforderungen und strategische Lösungen für die Implementierung von NGS in der Phagenforschung

Trotz seines transformativen Potenzials steht die NGS vor einzigartigen Hindernissen in der Phagenforschung, die gezielte Lösungen erfordern:

1. Komplexitäten der Probenvorbereitung

• Herausforderung: Effiziente virale Anreicherung bei gleichzeitiger Vermeidung von bakterieller DNA-Kontamination während der Zelllyse
  • Strategie: Optimierte Filtration (0,22 μm Membranen), Dichtegradientenzentrifugation, zentrifugale Ultrafiltration und enzymatische Abbau (DNase/RNase) freier Nukleinsäuren
• Herausforderung: Ultratiefe virale Nukleinsäurekonzentrationen in Umweltproben
  • Strategie: Hochleistungs-Extraktionskits kombiniert mit Technologien zur kostengünstigen Bibliothekskonstruktion

2. Bioinformatik-Herausforderungen

• Herausforderung: Zusammenbauprobleme durch sich wiederholende Sequenzen, hoch-GC-reiche Regionen und intergenetische Rekombination
  • Lösung: Hybride Assemblierungs-Pipelines (z.B. MetaSPAdes), ergänzt durch Langlese-Sequenzierung (PacBio/Nanopore)
• Herausforderung: Einschränkungen beim viralen Binning aufgrund fehlender universeller Marker-Gene
  • Lösung: Multi-Parameter-Binning unter Verwendung von K-Mer-Profilen, Abdeckungsvariationen und Wirtsinformationen, verbessert durch ML-Klassifizierer (VirFinder, DeepVirFinder, VIBRANT)
• Herausforderung: Ungenaue Vorhersage der Phagen-Wirt-Verknüpfung
  • Lösung: Integrierte Ansätze: CRISPR-Spacer-Ausrichtung, tRNA-Abgleich, Analyse der Sequenzzusammensetzung und gepaarte Metatranskriptom-Korrelation

3. Funktionale Annotationslücken

• Herausforderung: ~80% der Phagen-Gene haben keine funktionale Charakterisierung.
  • Strategie: Multimodale Untersuchung:
    • Hochdurchsatz-funktionales Screening (z. B. wirtsbasiertes Tn-seq)
    • KI-gesteuerte Strukturvorhersage (AlphaFold)
    • Homologiemodellierung
    • Experimentelle Validierung

Iv. Anwendungsbeispiele und Zukunftsperspektiven

Revolutionierung der Phagenbibliotheksbewertung durch NGS

1. Aufdeckung kritischer Bibliotheksmängel

• Ungenaue Titerberichterstattung: Die quantifizierten Phagentiter betrugen lediglich 1/43 der Angaben des Herstellers (was auf ein systemisches Problem hinweist) und erhöhten erheblich das Risiko, seltene Peptide während des Screenings zu verlieren.
• Wildtyp-Klon-Kontamination: Unvollständige Vektordigestion führte zu 9,65 % nicht-funktionalen Wildtyp-Klonen, was zu einer nicht gezielten Anreicherung führte, die die Screening-Fidelität beeinträchtigt.
• Häufige Sequenzfehler: Die Analyse ergab, dass 8 % der Sequenzen vorzeitige Amber-Stoppcodons enthielten (was auf eine unzureichende Unterdrückung des Wirts hindeutet), sowie 0,075 % Verschiebungen des Leserahmens, die auf Fehler bei der Oligonukleotidsynthese zurückzuführen sind.

2. Offenlegung systematischer Sequenzverzerrungen

• Fehler in der Aminosäurezusammensetzung:
  • Eine abnorm hochfrequente Cystein (C) Häufigkeit wurde beobachtet; ungepaarte Cysteine sind bekannt dafür, die Assemblierung von Phagenpartikeln zu stören.
  • Systemische Erschöpfung von Arginin (R), einem positiv geladenen Rest, der für den Transport entscheidend ist, behindert die SecY-abhängige Membrantranslokation.
• Positionsspezifische Einschränkungen: Signifikanter Bias bestand an bestimmten Restpositionen, insbesondere:
  • Vermeidung von N-terminalem Prolin (Pro), das die Spaltung durch Signalpeptidase hemmt.
  • N-terminale Reste wiesen insgesamt die stärksten Verzerrungen auf, die die Effizienz der Peptidsekretion direkt beeinflussten.

3. Entdeckung latenter Bibliotheksheterogenität

• Nicht-zufällige Peptidverteilung: Die Peptidabundanz folgte einem stark schiefen, langgezogenen Muster, das von einer begrenzten Anzahl vorherrschender Sequenzen dominiert wurde, anstatt einer theoretischen zufälligen Verteilung.
• Rezessive Wettbewerbsanreicherung: Schnell proliferierende Klone (Pr-TUP) besitzen von Natur aus einen Wachstumsvorteil während der ungesichteten Bibliotheksamplifikation, was die Repräsentation unabhängig von der Zielbindung verzerrt.

4. Überwindung traditioneller QC-Einschränkungen

• Die konventionelle Qualitätskontrolle (QC) von Herstellern, die sich auf die Sanger-Sequenzierung von nur etwa 100 Klonen stützt, versagt darin, Folgendes zu erkennen:
  • Defekte Sequenzen, die mit niedriger Frequenz auftreten (z. B. Frameshift-Mutationen).
  • Die komplexen Subpopulationsstrukturen, die durch die Hauptkomponentenanalyse (PCA) identifiziert wurden, zeigten vier distincte Cluster (Sloth AB et al., 2022).

Gestapeltes Balkendiagramm mit farbcodierten Segmenten, die Sequenzen entsprechend ihrer Häufigkeit gruppieren (siehe Farbschlüssel) (Sloth AB et al., 2022)

Die transformative Auswirkung von NGS auf die Entdeckung von Phagen-Antikörpern

1. Überwindung wichtiger technologischer Einschränkungen

• Kurzlese-Beschränkungen: Konventionelle NGS-Plattformen (z. B. Illumina) sind aufgrund von Einschränkungen der Leselänge auf die Analyse einzelner Antikörperdomänen (wie VHHs) beschränkt.
• Langzeitlösung: PacBio SMRT-Sequenzierung, die kontinuierliche Reads von über 1000 bp erzeugt, ermöglicht die direkte Erfassung von vollständigen scFv-Sequenzen, einschließlich wichtiger Informationen zur Paarung von leichten und schweren Ketten.

2. Kernvorteile von SMRT-NGS

• SMRT-NGS bietet erhebliche Verbesserungen gegenüber traditionellen Methoden:
  • Umfassende Sequenzaufnahme: Im Gegensatz zu Ansätzen, die eine segmentierte PCR-Assemblierung erfordern, bietet SMRT eine Einzel-Leseabdeckung ganzer scFvs (~750 bp).
  • Dramatisch beschleunigter Zeitrahmen: Prozesse, die Monate für Screening und Validierung benötigen, werden innerhalb von Tagen abgeschlossen.
  • Zugriff auf verborgene Vielfalt: Dieser Ansatz isoliert erfolgreich funktionelle "Stealth"-Antikörper, die oft von routinemäßigen Screening-Protokollen übersehen werden.

3. Experimentelle Validierung

• Die Validierung unter Verwendung von Zelloberflächenantigenen (CD160/CD123) zeigte:
  • Hohe funktionale Erfolgsquote: 75-81 % der hochfrequenten Klone wiesen eine Zielbindungsfähigkeit ohne zusätzliche Screening-Verfahren auf.
  • Beibehaltung nativer Eigenschaften: Die direkte Akquisition natürlich gepaarter Leicht-/Schwerketten-Sequenzen bewahrt entscheidende Merkmale der Affinitätsreifung in vivo.

4. Aktuelle Einschränkungen ansprechen

• Durchsatzbeschränkung: Einzelne SMRT-Läufe liefern etwa 80.000 Reads, was erheblich niedriger ist als die Millionen von Illumina.
• Minderungsstrategie: Eine tiefere Abdeckung zu erreichen, erfordert eine erheblich erhöhte Sequenzierungstiefe (10x), allerdings zu verhältnismäßig höheren Kosten (10x).

5. Strategische Positionierung

• Vorteil gegenüber Einzelzellmethoden: SMRT-NGS bietet ~50% niedrigere Kosten, beseitigt komplexe Manipulationen lebender Zellen und ermöglicht das Screening einer erheblich größeren Bibliotheksvielfalt.
• Einzigartiges Wertversprechen: Es bleibt die einzige Lösung, die die immense Kapazität von Phagen-Display-Bibliotheken mit der entscheidenden Beibehaltung der natürlichen Licht-/Schwerketten-Paarungsinformationen kombiniert (Nannini F et al., 2021).

Identifizierung alternativer Binder im NGS-Datensatz (Nannini F et al., 2021)

Revolutionierung des Phagen-Display-Verfahrens zur Screening von arsenbindenden Peptiden mittels NGS

1. Überwindung traditioneller Screening-Beschränkungen

• Aufdeckung verborgener Motive: Illumina NGS ermöglichte eine tiefe Sequenzabdeckung und enthüllte kritische Bindungsmotive (QxQ, SxHS), die zuvor durch Sanger-Sequenzierung nicht nachweisbar waren (<0,1% Nachweisrate).
• Eliminierung von Störungen: NGS identifizierte signifikante Verunreinigungen: 43% Wildtyp-Phagen (verursacht durch Vektorrestriktionsdefekte) und hochproliferative parasitäre Peptide (z. B. FHMPLTDPGQVQ, die einen 89-fachen Amplifikationsvorteil aufweisen), die die Screening-Ergebnisse verzerren.

2. Kernmechanistische Einblicke in die Arsenbindung

• QxQ-Motiv (Carboxy-Terminus): L-Glutaminreste innerhalb dieses Motivs bilden Wasserstoffbrücken mit Arsenit-Anionen (AsO₃³⁻).
• SxHS-Motiv: Die zentrale Histidin-Rest koordiniert direkt das Arsen-Atom.
• Paradigmenwechsel: Diese Ergebnisse stellen die historische Ansicht grundlegend in Frage, dass Cysteinreste ausschließlich für die Bindung von Arsen verantwortlich sind.

3. Innovativer Analytischer Rahmen

• Kernpunkt-Algorithmus: Dieses rechnergestützte Werkzeug filtert Sequenzen mit proliferativer Dominanz heraus und stellt sicher, dass echte arsenbindende Peptide erhalten bleiben.
• Wiedergewinnung seltener Binder: Die Methode identifiziert erfolgreich funktionelle Peptide mit geringer Häufigkeit (z. B. QLQLDMDLSLHS mit 0,01% Häufigkeit), die von herkömmlichen Ansätzen übersehen werden.
• Open-Source-Visualisierung: Die Häufigkeit und Struktur von Motiven werden mit etablierten Werkzeugen (pLogo, MEME) analysiert und visualisiert.

4. Nachgewiesener praktischer Wert

• Beschleunigte Entdeckung: NGS ermöglicht die direkte Identifizierung funktioneller Peptidsequenzen, wodurch die Abhängigkeit von umfangreicher Validierung im Labor drastisch reduziert und die Entwicklungszyklen verkürzt werden.
• Umweltremediation-Potenzial: Die identifizierten hochaffinen Peptide dienen als Entwurfsvorlagen für neuartige Biosorbentien, die auf die Reinigung von Arsenverschmutzung abzielen (Braun R et al., 2020).

Fixierung von Arsen auf dreirädrigen Säulen zur Biobalance und Berechnung der Kernfraktionen in QxQ (Braun R et al., 2020).

NGS-gesteuerte Fortschritte bei antiviralen Peptidtherapeutika gegen SARS-CoV-2

1. Beschleunigte Hochdurchsatzentdeckung

• Dekodierung im Milliardenmaßstab: NGS verarbeitet bibliotheksgroße Daten innerhalb von 5 Tagen – eine Aufgabe, die mit herkömmlichem Screening Monate in Anspruch nimmt – und ermöglicht die schnelle Identifizierung von 5 zentralen strukturellen Motiven, die 96 % der funktionalen Sequenzen repräsentieren.
• Intelligente Sequenzpriorisierung: Automatisierte Clusterung filtert unspezifische Binder und gibt direkt hochaffine Kandidaten wie CVRBDL-3 (K_D = 1,3 μM) aus.

2. Präzise Wirkmechanismen aufklären

• Duale antivirale Funktionen:
  • Prävention: Blockiert die anfängliche Bindung des Spike-Proteins an hACE2-Rezeptoren.
  • Störung: Dissoziiert vorgebildete Spike-hACE2-Komplexe.
• Variantenresistenz: Beibehaltung einer starken Hemmung gegen sich entwickelnde Stämme (z. B. B.1.1.7) durch gezielte Ansprache konservierter Spike-Regionen, die durch NGS-Analysen identifiziert wurden.

3. Ermöglichung der rationalen Peptid-Entwicklung

• Bivalente Design-Optimierung: Strukturelle Einblicke aus der CVRBDL-3-gesteuerten Erstellung eines bivalenten Analogons, das ergibt:
  • 3-fach höhere Bindungsaffinität (IC₅₀ = 47 nM)
  • 10-fach langsamere komplexe Dissoziation (verlängerte hemmende Wirkung)
• Evasionsfokussierte Ingenieurwissenschaft: NGS-Kartierung bestätigte Bindungsstellen, die weit entfernt von häufigen Mutations-Hotspots der VOC liegen, wodurch das Risiko einer Immunflucht minimiert wird.

4. Therapeutische Vorteile der Translation

• Verbessertes Sicherheitsprofil: Verwendet nicht-menschliche Peptidgerüste, wodurch die Risiken von Nebenwirkungen im Vergleich zu ACE2-mimetischen Medikamenten verringert werden.
• Entwicklungsfähigkeit: Die Verträglichkeit mit der D-Enantiomer-Rückgratmodifikation verbessert die proteolytische Stabilität in vivo erheblich (Sevenich M et al., 2022).

CVRBDL-3 und CVRBDL-3_3 verdrängen hACE2 aus dem vorgeformten Komplex mit SARS-CoV-2 S1S2 (Sevenich M et al., 2022)

Fazit

NGS hat die Phagenforschung revolutioniert, indem es beispiellose analytische Fähigkeiten bereitstellt und sich als Grundpfeiler der modernen Virologie etabliert hat. Diese Technologie ermöglicht eine umfassende Erforschung über verschiedene Skalen hinweg – von der präzisen Charakterisierung einzelner Virionen bis hin zur globalen Metavirom-Profilierung – und überbrückt grundlegende biologische Entdeckungen mit transformativen Anwendungen in der klinischen Therapie und im ökologischen Management. Durch kontinuierliche Fortschritte in vier Schlüsselbereichen:

• Probenvorbereitungsmethoden
• Langzeit-Sequenzierungsplattformen
• Bioinformatik-Algorithmen
• Integration von künstlicher Intelligenz

NGS entschlüsselt schrittweise die Komplexität der Phagenbiologie und ihre integrale Rolle in den Lebensnetzwerken der Erde. Als zentrale Triebkraft in diesem Bereich wird NGS weiterhin die wissenschaftlichen Grenzen erweitern und Innovationen in der Medizin, Umweltwissenschaft und grundlegenden Lebenswissenschaftsforschung vorantreiben.

Für weitere Informationen darüber, was Phagen-Sequenzierung ist, siehe "Was ist Phagen-Sequenzierung? Ein vollständiger Leitfaden für Forscher".

Für weitere Informationen zur Sequenzierung des M13-Phagen siehe "M13-Phagen-Genomsequenzierung: Von Display-Bibliotheken zur Datenanalyse.

Die Leute fragen auch

Was ist die Phagenanzeige der nächsten Generation Sequenzierung?

Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) in Kombination mit der Phagen-Oberflächenanzeige (PSD) sind leistungsstarke Werkzeuge im neu ausgestatteten molekularbiologischen Werkzeugkasten zur Identifizierung spezifischer zielbindender Biomoleküle.

Was ist eine Phagenanzeige?

Phagenanzeige ist eine Laborplattform, die es Wissenschaftlern ermöglicht, Proteininteraktionen im großen Maßstab zu untersuchen und Proteine mit der höchsten Affinität zu spezifischen Zielen auszuwählen.

Referenzen:

1. Soluri MF, Puccio S, Caredda G, Grillo G, Licciulli VF, Consiglio A, Edomi P, Santoro C, Sblattero D, Peano C. "Interactome-Seq: Ein Protokoll zur Konstruktion, Validierung und Auswahl von Domainome-Bibliotheken durch Phagenanzeige und Next-Generation-Sequenzierung." J Vis Exp2018 Okt 3;(140):56981. doi: 10.3791/56981
2. Tiu CK, Zhu F, Wang LF, de Alwis R. "Phagen-Immunopräzipitations-Sequenzierung (PhIP-Seq): Das Versprechen der Hochdurchsatz-Serologie." Pathogene2022, 11. Mai; 11(5):568. doi: 10.3390/pathogens11050568
3. Sloth AB, Bakhshinejad B, Jensen M, Stavnsbjerg C, Liisberg MB, Rossing M, Kjaer A. "Analyse des kompositionellen Bias in einer kommerziellen Phagen-Display-Peptidbibliothek durch Next-Generation-Sequenzierung." Viren. 2022 Okt 29;14(11):2402. doi: 10.3390/v14112402
4. Nannini F, Senicar L, Parekh F, Kong KJ, Kinna A, Bughda R, Sillibourne J, Hu X, Ma B, Bai Y, Ferrari M, Pule MA, Onuoha SC. "Kombination von Phagenanzeige mit SMRTbell-Nächste-Generation-Sequenzierung zur schnellen Entdeckung funktioneller scFv-Fragmente." mAbs2021 Jan-Dez;13(1):1864084. doi: 10.1080/19420862.2020.1864084
5. Braun R, Schönberger N, Vinke S, Lederer F, Kalinowski J, Pollmann K. "Anwendung von Next Generation Sequencing (NGS) in der Auswahl von phagenpräsentierten Peptiden zur Unterstützung der Identifizierung von Arsen-Bindungsmotiven." Viren2020, 27. Nov; 12(12):1360. doi: 10.3390/v12121360
6. Sevenich M, Thul E, Lakomek NA, Klünemann T, Schubert M, Bertoglio F, van den Heuvel J, Petzsch P, Mohrlüder J, Willbold D. "Phagenanzeige-abgeleitete Verbindungen verdrängen hACE2 aus seinem Komplex mit dem Spike-Protein von SARS-CoV-2." Biomedizinprodukte. 2022 Feb 14;10(2):441. doi: 10.3390/biomedicines10020441