Exosomale RNA-Seq-Workflow

Einführung

Exosomale RNA-Seq ist nicht nur eine Variante der standardmäßigen Transkriptomik – es ist ein Präzisionsworkflow, der für ein einzigartig komplexes biologisches Substrat entwickelt wurde. Exosomen, eine Klasse von extrazellulären Vesikeln mit einem Durchmesser von 30–150 nm, tragen RNA-Inhalte, die den physiologischen Zustand ihrer Ursprungszelle widerspiegeln. Dies macht exosomale RNA (exoRNA) zu einer unschätzbaren Ressource für das Verständnis der Zell-Zell-Kommunikation, der Krankheitsmechanismen und der Reaktionen auf Behandlungen auf nicht-invasive Weise. Um jedoch diese Erkenntnisse zu gewinnen, ist eine sorgfältige Anpassung in jeder Phase der RNA-Sequenzierungspipeline erforderlich.

Im Gegensatz zu zellulärem RNA ist exoRNA oft spärlich, fragmentiert und in seiner Zusammensetzung vielfältig. Es umfasst kleine nicht-kodierende RNAs wie Mikro-RNAs (miRNAs) sowie lncRNAs, zirkuläre RNAs und abgebauten mRNA-Fragmente. Diese RNA-Populationen sind oft in Nanogramm-Mengen vorhanden, was ultraempfindliche Arbeitsabläufe und strenge Kontaminationskontrollen erfordert, um echte exosomale Signale von Hintergrund-RNA (cfRNA) zu unterscheiden. Darüber hinaus erfordert die Variabilität des Exosomeninhalts in Plasma, Urin und Zellkulturüberständen kontextspezifische Handhabungs- und Analyse-Strategien.

Für Forscher, die Biomarker-Entdeckungen, Pfaduntersuchungen oder translationale Forschung in vitro oder in vivo verfolgen, sorgt ein dedizierter Exosomen-RNA-Seq-Workflow dafür, dass biologisch bedeutende Ergebnisse nicht durch schlechte Vorbereitung, ungeeignete Werkzeuge oder Fehlinterpretationen verloren gehen. Von der Probenwahl und -isolierung bis hin zu Sequenzierung und Interpretation muss jeder Schritt für die Nuancen der extrazellulären RNA-Biologie optimiert werden.

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Probenauswahl und -vorbereitung

Ein erfolgreiches Projekt zur RNA-Seq von Exosomen beginnt lange vor der Sequenzierung – es beginnt mit der Auswahl des richtigen Proben Typs und der Anwendung strenger Handhabungspraktiken. Da Exosomen in nahezu allen Bioflüssigkeiten vorhanden sind, haben Forscher mehrere Eingangsoptionen, aber jede bringt ihre eigenen technischen Kompromisse mit sich. Die Auswahl des am besten geeigneten Proben Typs basierend auf den Projektzielen, dem RNA-Ertrag und der Verarbeitungsfähigkeit ist entscheidend für den späteren Erfolg.

Häufige Biofluidquellen für Exosomen-RNA-Seq

Qualitätskontrollüberlegungen

Unabhängig vom Proben-Typ sind strenge prä-analytische Praktiken unerlässlich, um die RNA-Qualität zu schützen:

VerarbeitungszeitVerarbeiten Sie Plasma/Serum innerhalb von 2 Stunden nach der Entnahme, um eine Kontamination mit cfRNA durch lysierte Blutkörperchen zu vermeiden.

ZentrifugationVerwenden Sie mindestens eine zweistufige Zentrifugation, um Debris und apoptotische Körper vor der Exosomenisolierung zu entfernen.

SpeicherAliquotieren Sie die Proben und frieren Sie sie bei −80 °C ein, um eine Frost-Tau-Degradation zu vermeiden.

VolumenStellen Sie sicher, dass ausreichend Ausgangsmaterial vorhanden ist. Für Plasma werden in der Regel 1–2 mL benötigt, um genügend RNA für die Sequenzierung zu erhalten.

Die Wahl des richtigen Inputs betrifft nicht nur den Komfort – sie hat direkte Auswirkungen auf die RNA-Integrität, die Komplexität der Bibliothek und letztendlich die Auflösung Ihrer biologischen Erkenntnisse.

Verwandte Lektüre: So bereiten Sie Proben für die Exosomen-RNA-Sequenzierung vor: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung

Exosomen-Isolierung und RNA-Extraktionsoptionen

Die Isolation von Exosomen und die RNA-Extraktion bilden das Fundament eines erfolgreichen RNA-Seq-Workflows für Exosomen. Diese vorgelagerten Schritte beeinflussen direkt die Qualität, Reinheit und Interpretierbarkeit Ihrer Sequierungsdaten. Da exosomale RNA in geringer Menge vorhanden und stark anfällig für Kontaminationen (insbesondere durch zellfreie RNA oder Proteinkomplexe) ist, müssen die Methoden zur Anreicherung von Vesikeln und zur RNA-Reinigung sorgfältig ausgewählt werden.

Häufige Methoden zur Isolierung von Exosomen

Jede Methode bietet Kompromisse zwischen Reinheit, Skalierbarkeit, Kosten und Benutzerfreundlichkeit:

Für Probenarten wie Plasma oder Urin, SEC gefolgt von Ultrafiltration kann ein gutes Gleichgewicht zwischen Reinheit und Ausbeute bieten. Für Zellkulturmedien, Ultrazentrifugation bleibt aufgrund des niedrigen Hintergrundgeräuschs eine bevorzugte Methode.

RNA-Extraktion aus isolierten Exosomen

Die RNA-Ausbeute aus Exosomen liegt typischerweise bei der Nanogramm Bereich, und die RNA-Population umfasst einen hohen Anteil an kleinen RNAs. Die Wahl der Extraktionsmethode sollte priorisieren:

Retention von kleinen RNAs (z. B. miRNAs)

Vermeidung von Verunreinigungen wie Phenol, Guanidinium oder verbleibende Proteine

Pufferkompatibilität mit nachgelagerter Bibliotheksvorbereitung (z. B. kein EDTA)

Beliebte Methoden sind:

• Phenolfreie, säulenbasierte Kits, die für kleine RNAs optimiert sind (z.B. Norgen, Qiagen miRNeasy)
• Magnetische Bead-basierte Kits, die Automatisierungspotenzial und sauberere RNA in Niedervolumen-Anwendungen bieten.
• TRIzol-basierte Methoden (weniger bevorzugt aufgrund von Reproduzierbarkeit und Toxizitätsbedenken)

Qualitätskontrollmetriken zur Zielsetzung:

• RNA-Konzentration ≥1 ng/µL
• Gesamter RNA-Ertrag ≥20 ng
• OD260/280 zwischen 1,8–2,2; OD260/230 ≥2,0
• RIN ≥6,5 bei Verwendung von Gesamt-RNA; Bioanalyzer-Diagramme empfohlen

 Verwandte Lektüre Die richtige RNA-Isolationsmethode für Exosomen auswählen

Sorgfältige Beachtung dieser Schritte stellt sicher, dass Ihre exosomale RNA nicht nur in ausreichender Menge vorhanden ist, sondern auch frei von Inhibitoren, die die Bibliothekskonstruktion und die Sequenzierungsgenauigkeit beeinträchtigen können.

Bibliothekskonstruktion – miRNA- vs. Gesamt-RNA-Strategien

Die Bibliotheksvorbereitung ist ein entscheidender Schritt im RNA-Seq-Workflow von Exosomen, der sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität Ihrer Ergebnisse bestimmt. Da Exosomen eine komplexe Mischung von RNA-Spezies transportieren – einschließlich kleiner RNAs wie miRNAs und fragmentierter langer RNAs wie lncRNAs und mRNA-Reste – muss die Wahl der Bibliotheksstrategie mit Ihrer biologischen Fragestellung und den Probenbeschränkungen übereinstimmen.

miRNA-Bibliothekskonstruktion

Exosomale miRNAs sind kurz (~22 Nukleotide), reichlich vorhanden und oft zentral für regulatorische Signale. Ihre kleine Größe erfordert einen speziellen Arbeitsablauf, der Folgendes umfasst:

Sequentielle Adapter-LigationSpezialisierte 3′- und 5′-Adapter werden an die Enden kleiner RNAs ligiert, um eine nachfolgende Amplifikation zu ermöglichen.

GrößenauswahlEin Reinigungsschritt reichert selektiv kleine RNAs (typischerweise 18–30 nt) an und entfernt tRNA-Fragmente sowie andere Nicht-Ziel-RNAs.

Molekulare Indizierung (optional)Einige Arbeitsabläufe integrieren Sequenz-Tags während der Bibliotheksvorbereitung, um einzigartige RNA-Moleküle zu verfolgen und Amplifikationsverzerrungen zu reduzieren.

Reverse Transkription und AmplifikationDie adapter-ligierten RNAs werden in cDNA umgewandelt und durch PCR amplifiziert.

Für exosomale RNA-Proben, die oft wenig Input und teilweise degradiert sind, werden Protokolle bevorzugt, die die Bildung von Adapter-Dimeren und Amplifikationsbias minimieren.

Gesamt-RNA-Bibliothekskonstruktion (für lncRNA, mRNA-Fragmente und andere lange RNAs)

Wenn das Ziel darin besteht, kodierende oder lange nicht-kodierende RNA-Fragmente in Exosomen zu untersuchen, ist die Vorbereitung einer Gesamt-RNA-Bibliothek der geeignete Weg. Diese Arbeitsabläufe umfassen typischerweise:

rRNA-EntfernungRibosomale RNA wird abgebaut, um den Gehalt an nicht-rRNA-Inhalten zu erhöhen. Dies ist entscheidend, da Poly(A)-Schwänze in vesikel-abgeleitetem RNA häufig fehlen oder verkürzt sind.

Fragmentierung (optional)Wird normalerweise für exosomales RNA übersprungen, da die in Vesikeln enthaltenen Transkripte bereits in kürzere Fragmente abgebaut sind.

Zufällige Priming und Reverse TranskriptionRNA wird unter Verwendung von Primern, die eine breite Palette von Transkripttypen abdecken, in cDNA umgewandelt.

Strang-spezifische AmplifikationHält die Transkript-Richtung bei, was die nachgelagerte Annotation und Interpretation unterstützt.

Bei der Arbeit mit sehr geringen RNA-Mengen stellen Sie sicher, dass das Protokoll mit Low-Input-Workflows (z. B. Nanogramm-Skala oder darunter) kompatibel ist.

Vergleichende Zusammenfassung

Vergleich der Arbeitsabläufe zur Vorbereitung von kleinen RNA- und Gesamt-RNA-Bibliotheken für exosomales RNA-Seq.

Sobald Ihre Bibliotheksvorbereitungsstrategie festgelegt ist, besteht der nächste Entscheidungspunkt darin, die richtige auszuwählen. Sequenzierungsplattform und Leseparameter um Ihre Studienziele zu erreichen.

Sequenzierungsplattformen und Leseparameter

Sobald die Bibliotheken vorbereitet sind, besteht die nächste entscheidende Entscheidung darin, geeignete Sequenzierungsparameter auszuwählen. Exosomale RNA, insbesondere aus Low-Input- oder kleinen RNA-angereicherten Bibliotheken, erfordert optimierte Einstellungen, um Abdeckung, Spezifität und Interpretierbarkeit sicherzustellen. Während die meisten Workflows Plattformen für Kurzlesesequenzierung verwenden, hängt die ideale Konfiguration von der Art der Bibliothek und der biologischen Fragestellung ab.

Empfohlene Sequenzierungsplattformen

Kurzzeit-Lese-Nächste-Generations-Sequenzierung (NGS) Plattformen – insbesondere solche, die eine hohe Durchsatzrate und hohe Basisaufrufgenauigkeit bieten – bleiben der Goldstandard für die meisten exosomalen RNA-Seq-Projekte.

Für die meisten Exosomen-RNA-Seq-Studien, Illumina-Style Kurzleseplattformen werden aufgrund ihrer Genauigkeit und Kompatibilität mit kleinen RNA-fokussierten Arbeitsabläufen bevorzugt.

Sequenzierungsparameter nach Bibliothekstyp

Einzelend-Reads sind ausreichend für kurze RNA-Spezies wie miRNAs.

Pair-End-Reads Verbessern Sie die Ausrichtungsqualität und die Isoformdiskriminierung in Gesamt-RNA-Workflows.

Lese-Tiefe beeinflusst die Sensitivität. Für die Entdeckung von Biomarkern oder Transkripten mit geringer Häufigkeit wird eine tiefere Sequenzierung empfohlen.

Qualitätskontrolle während der Sequenzierung

Stellen Sie sicher, dass die Plattform Folgendes bietet:

• Hohe Q30-Werte (>85% der Reads)
• Niedriges Index-Hopping (besonders wichtig für multiplexierte kleine RNA-Bibliotheken)
• Ausgewogene GC-Gehalt-Darstellung
• Cluster-Passfilter (≥80%)

Die Auswahl der richtigen Sequenzierungsanordnung hilft, das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren und stellt sicher, dass Ihre Bibliotheken verwendbare, reproduzierbare Daten liefern – egal, ob Sie miRNAs profilieren oder exosomale Transkriptfragmente rekonstruieren.

Bioinformatik-Workflow – Von Rohdaten zu Expressionsmatrix

Die rechnerische Pipeline ist ebenso wichtig wie der Arbeitsablauf im Feuchtlabor bei der RNA-Seq von Exosomen. Angesichts der geringen Größe, des niedrigen Inputs und der unterschiedlichen RNA-Typen in extrazellulären Vesikeln müssen standardisierte RNA-Seq-Workflows angepasst werden. Dieser Abschnitt skizziert eine typische Schritt-für-Schritt-Datenverarbeitungs-Pipeline, die auf exosomale RNA zugeschnitten ist – egal, ob Sie miRNAs, lncRNAs oder mRNA-Fragmente profilieren.

Schritt 1: Qualitätskontrolle (QC) der Rohdaten

WerkzeugeFastQC, MultiQC

ZweckBewerten Sie die Basisqualität, den GC-Gehalt, die Adapterkontamination und die Duplikation der Reads.

• Kleine RNA-Bibliotheken enthalten häufig Adapter-Dimere und kurze Reads; das Trimmen ist unerlässlich.
• Kennzeichnete Probleme wie niedrige Basisqualität oder Adapterkontamination müssen vor der Kartierung behoben werden.

Schritt 2: Adapterkürzung und Filterung

WerkzeugeCutadapt, Trimmomatic

• Entfernen Sie Sequenzierungsadapter, niedrigqualitative Basen (Q<20) und kurze Reads (<15 bp für miRNAs).
• Bei totalen RNA-Bibliotheken sicherstellen, dass ribosomale Sequenzen oder Poly(A)-Artefakte beschnitten werden, wenn sie nicht experimentell entfernt wurden.

Schritt 3: Zuordnung zum Referenzgenom oder Transkriptom

miRNA-Kartierung:

• Aligner: Bowtie, STAR (mit miRNA-Modus)
• Referenz: Reife miRNAs aus miRBase

Gesamt-RNA-Kartierung:

• Aligner: STAR oder HISAT2
• Referenz: GENCODE, Ensembl oder artspezifisches Transkriptom
• Exosomale RNA kann degradierte oder fragmentierte Transkripte enthalten – permissive Mapping-Parameter helfen, echte Ausrichtungen zu erfassen.

Schritt 4: Quantifizierung

miRNA:

• Verwenden Sie featureCounts, HTSeq oder spezialisierte Tools wie miRDeep2 oder sRNAbench, um miRNA-Reads zu zählen.

Gesamt-RNA:

• Für lncRNA/mRNA verwenden Sie featureCounts, Salmon oder RSEM zur Schätzung der Transkript-Abundanz auf Ebene der Transkripte.

Schritt 5: Normalisierung

WerkzeugeDESeq2, edgeR oder TPM/CPM-Berechnung

• Normalisieren, um die Sequenzierungstiefe und die Bibliothekszusammensetzung zu berücksichtigen.
• Log-transformierte Zählungen verbessern oft die nachgelagerte Analyse.

Ausdrucksmatrix

Die endgültige Matrix ist eine Tabelle von Gen-/miRNA-IDs im Vergleich zu normalisierten Lesezahlen – bereit für nachgelagerte funktionale Analysen oder differentiellen Ausdruck.

Workflow-Diagram des Exosom-RNA-Seq-Bioinformatik-Pipelines von Rohdaten zu Expressionsmatrix.

Dieser bioinformatische Workflow ist das rechnerische Rückgrat der exosomalen RNA-Seq. Er stellt sicher, dass selbst Transkripte auf Pikogramm-Niveau mit wissenschaftlicher Strenge und statistischer Zuverlässigkeit interpretiert werden.

Funktionale und Weganalyse

Sobald Ihr exosomales RNA-Seq-Datensatz kartiert und normalisiert ist, besteht der nächste Schritt darin, biologische Bedeutungen zu extrahieren. Funktionale und Weganalysen helfen dabei, die Ergebnisse der differentiellen Expression zu kontextualisieren und aufzuzeigen, wie exosomvermittelte Signale zelluläre Wege, Immunantworten oder interzelluläre Kommunikation beeinflussen könnten. Diese nachgelagerten Werkzeuge sind besonders wertvoll, wenn kleine RNAs wie miRNAs untersucht werden, die oft die Genexpression indirekt über Ziel-mRNA-Netzwerke regulieren.

Genomontologie (GO) und Pfadanreicherung

Werkzeuge:

• GOseq, clusterProfiler (R-Pakete)
• g:Profiler (webbasiertes Tool)
• KEGG Mapper

Anwendungen:

• Identifizieren Sie überrepräsentierte biologische Prozesse (z. B. Apoptose, Angiogenese)
• Klassifizieren Sie exosomales mRNA oder lncRNA-Ziele in kanonische Wege.
• Untersuchen Sie die Beteiligung von Vesikeln an der Stressreaktion, der Immunmodulation oder der Entwicklungssignalisierung.

Beispiel:

Ein unterschiedlich exprimiertes Set von lncRNAs aus Exosomen, die aus hypoxie-konditionierten Zellen isoliert wurden, könnte Wege wie "HIF-1-Signalgebung" oder "VEGF-Rezeptoraktivität" bereichern – was auf einen funktionalen Zusammenhang zwischen dem Inhalt der Vesikel und der Anpassung an Umweltstress hinweist.

miRNA-Zielvorhersage und Netzwerk-Analyse

Werkzeuge:

• miRNet (Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von Webseiten übersetzen. Wenn Sie spezifischen Text haben, den Sie übersetzen möchten, können Sie ihn hier eingeben.)
• TargetScan
• miRWalk

Anwendungsfälle:

• Vorhersage von Zielgenen von hochregulierten oder herunterregulierten miRNAs
• Erstellen Sie regulatorische Netzwerke, die zeigen, wie exosomale miRNAs Signalwege in empfangenden Zellen stilllegen können.
• Führen Sie eine Anreicherung für vorhergesagte Ziele durch (z. B. GO, KEGG, Reactome)

Überlegungen zu exosomaler RNA

• Eine niedrige RNA-Abundanz bedeutet weniger nachweisbare Ziele – konzentrieren Sie sich auf konsistente, moderat exprimierte Transkripte und nicht nur auf extreme Faltänderungen.
• Fragmentierte mRNAs stimmen möglicherweise nicht mit den kanonischen 3′ UTRs überein; interpretieren Sie die Ergebnisse vorsichtig.
• Vesikelspezifische Wege (z. B. endosomaler Transport, Exozytose) können besonders relevant sein, wenn man die Frachtprofile analysiert.

Für explorative Studien bietet die Kombination von miRNA–mRNA-Korrelation mit der Pfadanalyse eine systematische Perspektive auf die Funktion von Exosomen.

Die funktionale Analyse wandelt Sequenzierungsergebnisse aus einer Zähltabelle in biologische Erkenntnisse um – indem sie Ihre Ergebnisse auf die zellulären Prozesse abbildet, die für Ihr Forschungsmodell am wichtigsten sind.

Dateninterpretation und biologischer Kontext

Selbst mit hochwertiger Sequenzierung und robuster Analyse, Biologische Einsichten hängen von der korrekten Interpretation ab.Exosomale RNA-Daten stellen einzigartige Herausforderungen dar, die sich von zellulären Transkriptomen unterscheiden – sowohl in der Zusammensetzung als auch in der kontextuellen Relevanz. Eine Fehlinterpretation der Daten kann zu falschen Schlussfolgerungen oder verpassten Entdeckungen führen.

Häufige Fallstricke bei der Interpretation von exosomaler RNA-Daten

Eine ordnungsgemäße Normalisierung (z. B. durch Verwendung von Größenfaktoren, Spike-Ins oder geeigneten Skalierungsmethoden) ist entscheidend für eine genaue Vergleichbarkeit zwischen Proben.

Praktische Tipps zur Interpretation von Ergebnissen zu exosomaler RNA

Mit biologischen Replikaten validieren – Eine einzelne Probe erzählt selten die ganze Geschichte. Zusammenlegung und Replikation verringern Verzerrungen.

Kreuzreferenzierung von Ausdrücken mit funktionalen Daten Unterstützt das Zielgen-Netzwerk eines miRNA ihre vorgeschlagene Rolle?

Verwenden Sie Vesikeldatenbanken für den Kontext. – Bestätigen Sie RNA-Spezies mit Vesiclepedia oder ExoCarta, um sicherzustellen, dass sie vesikelangereichert sind.

Mit Sorgfalt visualisieren – Verwenden Sie Heatmaps, Vulkanplots und miRNA-Zielnetzwerke, um Muster zu erkennen, aber interpretieren Sie sie statistisch.

Metadaten integrieren – Klinische Metadaten (z. B. Zeitpunkte, Behandlungen) helfen, biologische Trends in der Expression zu kontextualisieren.

Wann man Expertenunterstützung suchen sollte

• Niedriginput- oder degradierte Proben
• Widersprüchliche Ergebnisse zwischen den Replikaten
• Bedarf an interspezifischer Analyse
• Benutzerdefinierte Pfadanreicherung oder Cross-Omics-Integration

Wenn Sie sich über die Zuverlässigkeit oder Bedeutung Ihrer Daten unsicher sind, kann eine frühzeitige Konsultation mit einem Bioinformatiker kostspielige Fehltritte verhindern.

Verwandte Literatur: Interpretation von Exosomalen RNA-Sequenzierungsdaten

Fallstudienbeispiel – Exosomale RNA-Sequenzierung in Aktion

Eine Studie aus dem Jahr 2024, veröffentlicht in BMC Krebs von Huang et al. untersuchten das Potenzial von plasmaderiviertem exosomal RNA als nicht-invasive Biomarker zur Erkennung von hepatozellulärem Karzinom (HCC). Die Forscher identifizierten drei Gene—CDK1, FEN1, und PCNA—die in den Plasmaxsomen von HCC-Patienten im Vergleich zu Nicht-HCC-Individuen, einschließlich solcher mit Hepatitis-B-Virus (HBV)-Infektion und gesunden Kontrollen, signifikant hochreguliert waren.

Studienhöhepunkte:

DatenintegrationDie Studie analysierte mehrere öffentliche RNA-seq-Datensätze aus Lebergeweben (normal, peritumoral und Tumor), um differentielle exprimierte Gene zu identifizieren, die mit HCC assoziiert sind.

Biomarker-IdentifizierungDurch Pfadanreicherung und Analysen von Protein-Protein-Interaktionsnetzwerken wurden zunächst zehn Schlüsselgene identifiziert. Eine weitere Bewertung reduzierte dies auf drei Gene – CDK1, FEN1 und PCNA –, die eine signifikante Erhöhung in Plasma-Exosomen von HCC-Patienten zeigten.

DiagnosemodellEin Mehrschicht-Perzeptron (MLP) Modell wurde unter Verwendung der Expressionsniveaus dieser drei Gene entwickelt. Das Modell zeigte eine starke diagnostische Leistung, mit einer Fläche unter der Kurve (AUC) von 0,85 im Trainingssatz und 0,84 im Testsatz, nach Anpassung an Geschlecht und Alter.

Implikationen für die Forschung:

Diese Studie hebt den Nutzen von exosomalem RNA-Seq zur Identifizierung nicht-invasiver Biomarker für HCC hervor. Der Ansatz, Gewebe-RNA-Seq-Daten mit Plasma-exosomalen RNA-Profilen zu integrieren, kombiniert mit maschinellen Lerntechniken, bietet einen soliden Rahmen für die Entdeckung und Validierung von Biomarkern.

Referenz:

Huang H, Zhang M, Lu H, et al. Identifizierung und Bewertung von RNA-Biomarkern in Plasma-Exosomen für die nicht-invasive Diagnose von Leberzellkarzinom mittels RNA-Sequenzierung. BMC Krebs. 2024;24(1):1552. doi: 10.1186/s12885-024-13332-0

CD Genomics – Alles aus einer Hand: Exosomale RNA-Seq-Dienste

Bei CD Genomics bieten wir eine umfassende Lösung von Anfang bis Ende an. Exosomale RNA-Sequenzierungsdienstleistung maßgeschneidert für Forschungsteams in der Akademie, Biotechnologie und pharmazeutischen F&E. Unser Workflow basiert auf einem tiefen Verständnis der einzigartigen Herausforderungen, die mit der Analyse von extrazellulärem RNA verbunden sind, und ist optimiert für niedrig-input, vesikel-abgeleitetes RNA.

Was in unserem Service enthalten ist:

1. Technische Beratung

Wir beginnen mit der Überprüfung Ihrer Forschungsziele, des Proben Typs und der RNA-Qualität, um die Durchführbarkeit des Projekts sicherzustellen und die Eingabebedürfnisse zu steuern.

2. Qualitätskontrolle (QC) und RNA-Bewertung

Jede eingereichte RNA-Probe unterliegt einer strengen Qualitätskontrolle, einschließlich:

• RNA-Integritätszahl (RIN) oder kleines RNA-Profil
• OD260/280- und OD260/230-Verhältnisprüfungen
• Quantifizierung über Qubit und Bioanalyzer/TapeStation

3. Bibliothekskonstruktion

Wir unterstützen sowohl kleine RNA (z. B. miRNAs) als auch totale RNA (z. B. mRNA-Fragmente, lncRNA) Arbeitsabläufe. Alle Schritte sind sorgfältig optimiert für:

• Adapter-Ligations-Effizienz
• Fragmentwiederherstellung
• Verstärkungsbias-Kontrolle

4. Hochdurchsatz-Sequenzierung

Durch die Nutzung von Illumina-kompatiblen Plattformen bieten wir:

• Einzelend- oder Paarend-Lesungen
• Anpassbare Lese-Längen und -Tiefen (5M–30M Reads/Stichprobe)
• Barcode-Demultiplexing und Formatkonvertierung

5. Bioinformatische Analyse

Unser Bioinformatik-Team verarbeitet Rohdaten durch validierte Pipelines für:

• Adapter-Trimmung und Qualitätsfilterung
• Mapping zum Referenzgenom oder miRNA-Datenbank
• Expressionsquantifizierung (Zählungen, TPM/RPM)
• Differenzielle Expressionsanalyse (DESeq2, edgeR)
• Funktionelle Anreicherung (GO, KEGG, miRNA-Zielvorhersage)

6. Veröffentlichungsbereite Berichte und Visualisierungen

Sie erhalten ein umfassendes Lieferpaket, das Folgendes umfasst:

• Annotierte Gene/miRNA-Tabellen
• Vulkanplots, Heatmaps, Netzwerkdiagramme
• Weg- und funktionale Anreicherungsvisualisierungen
• Zusammenfassung der Methoden bereit für ergänzende Materialien

Warum CD Genomics?

• Spezialisierte Fachkenntnisse in der Extrazellulären RNA und vesikelbasierten Sequenzierung
• Hochsensitivitäts-Workflows für niedrig-input, fragmentierte RNA
• Transparente Datenübermittlung ohne Anbieterbindung
• Unterstützung für benutzerdefinierte bioinformatische Pipelines

Um Ihr Projekt von Anfang bis Ende zu optimieren, steht unser Team für Nachlieferungsberatungen und zusätzliche Dateninterpretationsunterstützung zur Verfügung.

Fazit – Zuverlässige Ergebnisse von Anfang bis Ende erhalten

Erfolgreich Exosomen-RNA-Seq beginnt lange bevor der Sequencer läuft – und reicht weit über rohe FASTQ-Dateien hinaus. Jede Phase des Workflows, von der durchdachten Probenauswahl und Vesikelisolierung bis hin zur maßgeschneiderten Bibliothekskonstruktion und nachgelagerter Bioinformatik, spielt eine entscheidende Rolle für die Datenqualität und Interpretierbarkeit.

Forscher, die mit exosomal RNA arbeiten, müssen sich mit geringen Eingabemengen, Fragmentierung und Kontaminationsrisiken auseinandersetzen. Mit der richtigen technischen Strategie und einem Partner, der Erfahrung mit extrazellulären RNA-Workflows hat, können Sie jedoch bedeutungsvolle, reproduzierbare Erkenntnisse aus diesen herausfordernden, aber informationsreichen Molekülen gewinnen.

Bei CD Genomics kombinieren wir fachspezifisches Know-how, flexible Serviceoptionen und transparente Datenbereitstellung, um Sie zu unterstützen. nicht-klinische Exosomen-RNA-Forschung—ob Ihr Ziel die Entdeckung von Biomarkern, die Erforschung von Mechanismen oder das transkriptomische Profiling ist.

Empfohlene nächste Schritte:

Laden Sie die Muster-Einreichungsrichtlinien (PDF) herunter.

Stellen Sie sicher, dass Ihre RNA die Reinheits- und Eingabekriterien erfüllt.

Lesen: So bereiten Sie Proben für Exosom-RNA-Seq vor

Verarbeiten Sie Fehler und verbessern Sie den Erfolg der Qualitätskontrolle.

Erforschen: Interpretation von Exosom-RNA-Sequenzierungsdaten

Lernen Sie, wie man Expressionsmatrizen in biologische Erkenntnisse umwandelt.