Wie man Proben für die Exosomen-RNA-Sequenzierung vorbereitet: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung

Einführung: Ein erfolgreiches Exosom-RNA-Projekt beginnt mit der richtigen Probenvorbereitung

In Exosomale RNA-SequenzierungDer häufigste Fehlerpunkt ist nicht der Bibliotheksaufbau oder die Datenanalyse – es ist die Probe.

Trotz der Fortschritte in der RNA-Seq-Technologie, Schlechte Probenvorbereitung bleibt ein Hauptgrund für fehlgeschlagene oder suboptimale Ergebnisse.Tatsächlich deuten interne Qualitätskontrollen und veröffentlichte Literatur darauf hin, dass über 50 % der Stichprobenfehler Fehler in der frühen Handhabung zurückverfolgen, einschließlich unsachgemäßer Sammlung, Abbau während des Transports oder Kontamination durch zellfreies RNA (cfRNA).

Warum ist exosomale RNA (exoRNA) so anfällig?

Niedrige HäufigkeitexoRNA ist in Nanogramm- oder sogar Pikogramm-Mengen vorhanden.

Kleine FragmentgrößeDie meisten exoRNAs sind kurz – insbesondere miRNAs, die während der Extraktion leicht verloren gehen.

Empfindlichkeit gegenüber DegradationVerzögerungen bei der Verarbeitung oder unsachgemäßes Einfrieren können die RNA-Qualität irreversibel schädigen.

Empfindlichkeit gegenüber KontaminationIm Gegensatz zu intrazellulärem RNA muss sich die ExoRNA-Präparation mit frei schwebendem RNA, Proteinen und Lipiden in Bioflüssigkeiten auseinandersetzen.

Deshalb ist eine ordnungsgemäße Probenvorbereitung kein nebensächliches Detail – sie ist das Grundlage Ihres gesamten ProjektsEgal, ob Sie eine Studie zur Entdeckung von Biomarkern, eine mechanistische Untersuchung planen oder einfach nur vesikelassoziierte Transkripte validieren möchten, die korrekte Vorbereitung Ihrer Proben stellt sicher, dass Sie beim ersten Mal zuverlässige Daten erhalten.

Dieser Artikel bietet einen standardisierte Schritt-für-Schritt-Anleitung um Ihnen zu helfen:

• Wählen Sie den richtigen Stichproben-Typ für Ihre Studie aus.
• Vermeiden Sie häufige Fallstricke bei der Sammlung und Aufbewahrung.
• Entscheiden Sie, ob Sie Exosomen selbst isolieren oder rohe Bioflüssigkeiten einreichen möchten.
• Bereiten Sie Ihre Proben für die Einreichung in unserer Sequenzierungsanlage vor.

Durch die Befolgung dieser Richtlinien werden Sie Verzögerungen reduzieren, die Datenqualität verbessern und auf Kurs in Richtung Ihrer Forschungsziele bleiben.

Wenn Sie neu in der Exosomen-Arbeitsabläufen sind, beginnen Sie hier: Exosomen-Isolierung zum miRNA-Extraktionsprotokoll

Schritt 1: Wählen Sie den richtigen Proben-Typ aus

Nicht alle Bioflüssigkeiten eignen sich gleichermaßen für die Analyse von exosomaler RNA. Der Erfolg Ihres RNA-Seq-Projekts beginnt oft mit der Auswahl des Proben Typs, der zu Ihren Forschungszielen, den Eingabebedürfnissen und den Erwartungen an den Ertrag exosomaler RNA passt.

Nachfolgend finden Sie einen Vergleich gängiger Probenarten, die in Studien zu exosomaler RNA verwendet werden:

Plasma (EDTA)

Warum es bevorzugt wirdPlasma, das mit EDTA gesammelt wurde, ist der Goldstandard in der Forschung zu exosomaler RNA aufgrund seines hohen Vesikel-Ertrags und seiner Kompatibilität sowohl mit miRNA- als auch mit mRNA-Profiling. Es ist auch relativ stabil und gut dokumentiert in verschiedenen Studien.

Am besten fürKrebsforschung, Immunüberwachung, Modelle für Infektionskrankheiten und allgemeine Entwicklung von Flüssigbiopsien.

Vermeiden Sie Heparinröhrchen.—residuales Heparin hemmt nachgelagerte PCR- und NGS-Workflows.

Urin

Warum es nützlich istUrin ist einfach nicht-invasiv zu sammeln und reich an Vesikeln aus den Nieren und den Harnwegen. Der exoRNA-Gehalt ist jedoch tendenziell niedriger als im Plasma, und Urin ist anfälliger für Abbau.

Am besten fürStudien, die sich auf die Nierenfunktion, metabolische Syndrome oder die nicht-invasive Erforschung von Biomarkern konzentrierten.

Speichel

Vor- und NachteileWährend es einfach zu sammeln und patientenfreundlich ist, zerfällt Speichel schnell und enthält reichlich RNasen. Außerdem weist es eine variable Exosomenausbeute zwischen Individuen und Zeitpunkten auf.

Am besten fürMachbarkeitsstudien oder Nischenanwendungen, bei denen andere Flüssigkeiten nicht verfügbar sind.

Zellkulturüberstand

Warum es ideal istExosome aus Kulturmedien sind hochrein, mit minimalem Hintergrund von cfRNA oder Plasmaproteinen. Forscher können Zeitpunkte, Stressbedingungen und Arzneimittelexpositionen steuern.

Am besten fürMechanistische Studien, Arzneimitteltests, Weganalyse und Zeitverlaufsversuche in vitro.

Die Wahl des richtigen Samples bestimmt den Ton für Ihr gesamtes Projekt. Im nächsten Abschnitt werden wir uns mit Beste Praktiken für die Probenentnahme und -konservierung—ein entscheidender Schritt zur Erhaltung der Integrität von exoRNA.

Schritt 2: Beste Praktiken für die Probenentnahme und -lagerung

Exosomale RNA ist äußerst empfindlich gegenüber Abbau, Kontamination und Umweltstress. Eine ordnungsgemäße Handhabung vom Zeitpunkt der Probenentnahme an ist entscheidend, um die RNA-Integrität zu gewährleisten und qualitativ hochwertige Sequenzierungsergebnisse zu sichern.

Dieser Abschnitt beschreibt wichtige Dos und Don'ts für Probenahme, Lagerung und Transport – basierend auf bewährten Praktiken, die in der Exosomenforschung etabliert und in Hunderten erfolgreicher Projekte validiert wurden.

Allgemeine Richtlinien

Verwenden Sie immer RNase-freie, sterile Verbrauchsmaterialien. für Röhrchen, Pipettenspitzen und Filter. RNase-Kontamination ist eine der Hauptursachen für die Degradation von exoRNA.

Muster deutlich kennzeichnen mit wasserfesten Markern oder bedruckten Aufklebern, die Frost standhalten. Vermeiden Sie Klebeband, das sich bei −80 °C ablöst.

Für Plasmaproben

Empfohlener SchlauchEDTA (lila Kappe).

Vermeiden Sie Heparin – es stört die PCR und die Bibliotheksvorbereitung.

Bearbeitungszeit: Zentrifuge innen 2 Stunden Sammlung um Plasma von Blutzellen zu trennen. Verzögerungen können zu einer erhöhten Freisetzung von cfRNA aus lysierten Zellen führen.

Sofort aliquot in Kryovials (200–500 µL pro Tube). Auftauen von Plasma nicht erneut einfrieren.

Für Urin, Speichel und Kulturüberstand

UrinZentrifugieren, um Zellen und Ablagerungen innerhalb von 1 Stunde zu entfernen. Fügen Sie Konservierungsmittel hinzu, wenn eine Verzögerung zu erwarten ist.

SpeichelVerwenden Sie Sammlungskits, die RNase-Inhibitoren enthalten, und frieren Sie sie sofort ein.

ZellkulturmedienSammeln Sie das Überstand bei vordefinierten Zeitpunkten, zentrifugieren Sie bei 2.000–3.000 g, um Zelltrümmer zu entfernen, und filtern Sie bei Bedarf.

Speicherempfehlungen

Temperatur: Alle Proben bei speichern −80 °CVerwenden Sie Kryovials, die für ultratiefe Temperaturen ausgelegt sind.

AliquotierungIn Einwegvolumen aufteilen, um Frost-Tau-Zyklen zu vermeiden.

Maximale HaltezeitFür die besten Ergebnisse, reichen Sie Proben innerhalb von 4–6 Wochen von der Sammlung, wenn sie ordnungsgemäß gelagert werden. Ältere Proben können eine QC-Vorbewertung erfordern.

Versand und Transport

Bevorzugte Methode: Schiff auf Trockeneisunter Verwendung von schaumisolierten Behältern.

Verpackung:

Schicht 1: Kryovials in einem versiegelten Plastikbeutel

Schicht 2: Tasche in einer sekundären versiegelten Box platziert (z. B. 50 ml konische Röhrchen)

Schicht 3: Alle Materialien in Trockeneis innerhalb eines schaumisolierten Versandbehälters verpackt.

Fügen Sie ein detaillierte Musterliste mit Beispielen für Namen, Volumen und Entnahmedaten.

Die Befolgung dieser Best Practices trägt dazu bei, dass Ihre Proben unversehrt ankommen und dass die RNA, die wir extrahieren, für die nachgelagerte Analyse geeignet ist – unabhängig davon, ob Sie kleine RNAs wie miRNAs oder vollständige Transkripte anvisieren.

Als Nächstes werden wir Ihre erläutern zwei Optionen zur Einreichung von Proben: rohes Biofluid oder vorisolierte Exosomen.

Schritt 3 – Bereiten Sie Ihre eigene exosomale RNA vor: Was Sie vor der Einreichung wissen müssen

CD Genomics ist auf exosomale RNA-Sequenzierungsdienste spezialisiert und verlangt von den Kunden, dass sie einreichen bereits extrahierte und gereinigte exosomale RNAWir bieten keine Dienstleistungen zur Isolierung von Exosomen oder zur RNA-Extraktion an. Um den Erfolg Ihres Projekts sicherzustellen, bitten wir Sie, die folgenden Einreichungsanforderungen zu beachten.

Was Sie einreichen müssen

ProbenartReines exosomales RNA, frei von Proteinen, DNA und enzymatischen Hemmstoffen.

MengeMindestens 20 ng pro Probe.

KonzentrationMindestens 1 ng/µL.

Reinheit:

OD260/280-Verhältnis zwischen 1,8 und 2,2.

OD260/230-Verhältnis ≥ 2,0.

IntegritätRNA-Integritätszahl (RIN) ≥ 6,5.

ElutionspufferRNase-freies Wasser oder 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), ohne EDTA oder andere Inhibitoren.

SpeicherBei -80 °C lagern; wiederholte Gefrier- und Auftauvorgänge vermeiden.

Referenz: CD Genomics Probeneinreichungsrichtlinien

Was zu vermeiden ist

Um Probleme zu vermeiden, die Ihre Sequenzierungsergebnisse gefährden könnten:

Nicht einreichen:

Gesamte Biofluide (z. B. Plasma, Urin, Speichel oder Zellkulturüberstand).

Unverarbeitete Exosomen oder Vesikelpellets.

Vermeiden:

Elutionspuffer mit hohen Salzkonzentrationen, SDS, Guanidinium oder Phenolrückständen.

Puffer mit EDTA, da es nachgelagerte enzymatische Reaktionen hemmen kann.

Wiederholte Frost-Tau-Zyklen von RNA-Proben. Wenn Sie sich über die Zusammensetzung Ihres Puffers oder Ihre Extraktionsmethode unsicher sind, kontaktieren Sie uns bitte für eine kostenlose Verträglichkeitsprüfung vor der Einreichung.

Empfohlene Isolations- und Extraktionspraktiken

Während CD Genomics keine spezifischen Marken unterstützt, empfehlen wir, dass Ihr Arbeitsablauf Folgendes umfasst:

Exosomen-IsolierungVerwenden Sie Ultrazentrifugation, Polyethylenglykol (PEG) Fällung oder affinitätsbasierte Methoden.

RNA-ExtraktionVerwenden Sie Protokolle, die für kleine RNAs optimiert sind, um eine minimale Übertragung von organischen Lösungsmitteln zu gewährleisten.

QualitätskontrolleBewerten Sie die RNA-Integrität mit einem Bioanalyzer oder TapeStation, um die RIN-Werte zu bestätigen.

Erforderliche Dokumentation

Bitte reichen Sie bei der Einreichung Ihrer Proben Folgendes ein:

Eine kurze Zusammenfassung Ihrer Protokolle zur Exosomenisolierung und RNA-Extraktion.

Details zur Pufferzusammensetzung, die in der finalen RNA-Probe verwendet wurde.

Konzentrationsmessungen und die verwendeten Methoden.

Diese Informationen helfen uns, die Kompatibilität der Eingaben zu bewerten und Ihre Bibliotheksvorbereitungsstrategie zu optimieren.

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

Was ist die minimale Menge an RNA, die für das Sequenzieren erforderlich ist?

Wir empfehlen ein mindestens 20 ng Gesamt-RNA pro Probe, bei einer Konzentration von ≥1 ng/µLFür kleine RNA- oder Low-Input-Workflows kontaktieren Sie uns bitte für eine Machbarkeitsprüfung.

Kann ich rohe Bioflüssigkeit oder isolierte Exosomen senden?

Nein. CD Genomics akzeptiert nur gereinigte exosomale RNA. Bitte extrahieren Sie RNA vor der Einreichung. Für empfohlene Extraktionsrichtlinien verweisen Sie auf unsere Muster-Einreichungsleitfaden.

Welches Puffer sollte ich verwenden, um meine RNA wieder in Lösung zu bringen?

Verwenden Sie RNase-freies Wasser oder 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Verwenden Sie keine Puffer mit EDTA, Phenol, Guanidinium oder hohem Salzgehalt, da diese nachgelagerte Enzyme hemmen können.

Bieten Sie RNA-Integritäts- und Quantifizierungsdienste an?

Ja. Alle eingereichten RNA-Proben werden einer Qualitätskontrolle (QC) durch Bioanalyzer oder TapeStation unterzogen (RIN ≥6,5 empfohlen), zusätzlich werden Konzentrations- und Reinheitsprüfungen über NanoDrop und Qubit durchgeführt. Sie erhalten einen vollständigen QC-Bericht.

Können Sie mit degradiertem oder niedrig-input RNA arbeiten?

Wir bewerten degradierte oder niedrig-input Proben fallweise. Wenn Ihre Probe unter den Standardgrenzen liegt, kontaktieren Sie uns bitte im Voraus für eine kostenlose technische Beratung.

Ich habe ein kommerzielles RNA-Extraktionskit verwendet – wird es funktionieren?

In den meisten Fällen, ja. Bitte teilen Sie jedoch Ihre Extraktionsmethode und die Pufferdetails mit, um uns bei der Bewertung der Kompatibilität zu helfen. Einige kommerzielle Kits hinterlassen hemmende Rückstände, die vermieden werden müssen.

Wie sollte ich RNA-Proben verpacken und versenden?

Lagern Sie RNA bei –80 °C und versenden Sie sie auf Trockeneis, unter Verwendung von auslaufsicheren Röhren in einem dreilagigen isolierten Behälter. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier- und Auftauzyklen.

Fazit: Hochwertige Proben führen zu hochwertigen Daten.

Bei der Sequenzierung von exosomaler RNA, Die Qualität Ihrer Daten ist nur so gut wie Ihre Probenvorbereitung.Von der Auswahl des richtigen Biofluids bis hin zur Gewährleistung der richtigen Lagerung und Pufferkompatibilität zählt jedes Detail. Eine unsachgemäße Handhabung kann zu niedrigen Erträgen, hoher Degradation oder unbrauchbaren Ergebnissen führen – was wertvolle Zeit und Budget verschwendet.

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