Protokoll zur Isolierung von Exosomen und Extraktion von miRNA

Exosomen-Isolation aus konditionierten Medien

1. Konditioniertes Medium sammeln.
2. Zentrifugieren Sie bei 500 g (RCF) für 10 Minuten bei 4 °C, mit maximaler Beschleunigung (während des gesamten Protokolls konstant) und maximaler Verzögerung (bis Schritt 9). Dadurch können lebende Zellen verworfen werden.
3. Entfernen Sie das Überstand in neue Röhrchen. Ohne das Pellet zu stören oder zu berühren, sammeln Sie das gesamte Medium über der genannten Linie und pipettieren Sie es dann in ein neues Röhrchen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 2 und 3.
5. Zentrifugieren Sie bei 2000 g für 15 Minuten bei 4 °C und übertragen Sie den Überstand in neue Röhrchen. Dadurch können tote Zellen verworfen werden.
6. Wiederhole Schritt 5.
7. Zentrifugieren Sie bei 10.000 g für 30 Minuten bei 4 °C und übertragen Sie den Überstand in neue Röhrchen. Dadurch können Zelltrümmer und große Vesikel verworfen werden.
8. Wiederholen Sie Schritt 7.
9. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 g für 1 Stunde bei 4 °C und reduzieren Sie die Bremskraft. Wenn Sie neue Maschinen der Serie (wie Optima XPN oder XE) verwenden, stellen Sie die Verzögerung auf "5"; bei älteren Serien (wie Optima L) stellen Sie auf "langsame Bremsung".
10. Entfernen Sie vorsichtig den Großteil des Überstands (immer die helle Linie vor dem runden Teil des Röhrchens beachten) mit einer großen Volumenpipette, während Sie beim Erreichen des Pellets eine 1-mL-Pipette verwenden. Lassen Sie 2/3 mL Überstand für eine bessere Lagerung Ihrer Vesikel.
11. Fügen Sie PBS hinzu, um Ihre Exosomenpräparation zu waschen und Verunreinigungen zu entfernen.
12. Zentrifugieren Sie bei 100.000 g für 1 Stunde bei 4 °C und reduzieren Sie die Bremskraft. Wenn Sie Maschinen der neuen Serie verwenden, stellen Sie auf "10"; bei Maschinen der vorherigen Serie stellen Sie auf "keine Bremse".
13. Entfernen Sie das Überstand wie in Schritt 10.
14. Resuspendieren Sie das Pellet in etwa 200 μL PBS.

Elektronenmikroskopie

1. Ausgehend von 200 μL Exosomenpräparation werden 25 μL in 275 μL 0,32% PBS-Citrat resuspendiert, um ein Endvolumen von 300 μL zu erreichen.
2. Verdünnen Sie 150 μL Exosomen in 150 μL 4% Paraformaldehyd, um eine Endkonzentration von 2% zu erreichen. Dieser Schritt dient dazu, Ihre Vesikel zu fixieren.
Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
4. Tragen Sie 10 μL fixierter Vesikel auf EM-Gitter, die mit Kohlenstoff/Formvar beschichtet sind, für 7 Minuten auf.
Färben Sie mit 2% Uranylacetat für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Lassen Sie die Vesikel 2 Stunden bei Raumtemperatur dehydrieren.
7. Bild mit TEM bei 100 kV.

Analyse des Inhalts von Exo-miRNAs

1. Resuspendieren Sie die Exosomenpräparation in 1 mL TRIzol-Reagenz. Schütteln Sie kräftig, vortexen Sie und lagern Sie es über Nacht bei −80 °C.
2. Tauchen Sie die Proben bei Raumtemperatur auf, fügen Sie 200 μL 2-Bromo-3-chlorpropan (oder Chloroform) hinzu und vortexen Sie das Röhrchen kräftig. Inkubieren Sie es 5 Minuten bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 15 Minuten bei 4 °C.
4. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen.
Fügen Sie 500 μL kaltes Isopropylalkohol hinzu und vortexen Sie kräftig.
6. Bei −80 °C für 1 Stunde einfrieren.
7. Zentrifugieren bei 12.000 g bei 4 °C.
8. Entfernen Sie Isopropylalkohol (so viel wie möglich) und fügen Sie 1 mL kaltes 75% Ethanol in DEPC-behandeltem H2O hinzu.
Zentrifugieren Sie bei 7500 g für 5 Minuten bei 4 °C.
10. Entfernen Sie Ethanol (so viel wie möglich).
11. Trocknen Sie das Pellet bei 42 °C, bis das Pellet trocken ist.
12. Resuspendieren Sie das Pellet in 15 μL DEPC-behandeltem H₂O (oder RNase-freies Wasser).
13. Quantifizieren Sie die extrahierte RNA mit dem NanoDrop 1000 Spektrophotometer.

RNA-Qualitätskontrolle

Gelvorbereitung

Übertragen Sie das gesamte Volumen (ca. 650 μL) der Small RNA-Gelmatrix in das obere Fach eines Spinfilters.
2. Platzieren Sie den Spinfilter in einer Mikrozentrifuge und zentrifugieren Sie ihn 15 Minuten lang bei 10.000 g.
3. Entfernen Sie den Filter.
4. Lag das gefilterte Gel bei 4 °C (bis zu 1 Monat) auf.

Gel-Farben-Mischung Vorbereitung

1. Vortexieren Sie das Small RNA-Farbstoffkonzentrat für 10 Sekunden und zentrifugieren Sie es.
Pipettiere 2 μL Farbstoff in 0,5 mL RNase-freie Mikrotuben. Die Gelmatrix ist sehr viskos; vermeide daher Vortexen und pipettiere langsam.
Fügen Sie 40 μL gefiltertes Gel hinzu.
4. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren oder durch Umkehren des Fläschchens, bis die Mischung homogen ist.
5. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 13.000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Gel-Färbemischung Laden

1. Nehmen Sie einen neuen Small RNA-Chip aus der versiegelten Tasche.
2. Legen Sie den Chip auf die Chip-Vorbereitungsstation.
3. Lassen Sie die Gel-Farben-Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur equilibreren, während Sie sie vor Licht schützen.
Pipettiere 9 μL der Mischung in den Boden des Wells.
Stellen Sie den Timer auf 60 s ein und stellen Sie sicher, dass der Kolben auf 1 ml positioniert ist.
6. Schließen Sie die Chip-Primierungsstation.
7. Drücken Sie den Kolben der Spritze nach unten, bis er vom Chip gehalten wird.
8. Warten Sie 60 Sekunden und lassen Sie dann den Kolben mit dem Chipfreigabemechanismus los.
9. Öffnen Sie die Chip-Primierungsstation und pipettieren Sie 9 μL der Gel-Farben-Mischung in jede der mit "G" gekennzeichneten Vertiefungen.

Kleine RNA-Bedingungslösung und Markerbeladung

Pipettiere 9 μL der Small RNA-Bedingungslösung in das gut markierte "CS"-Wells.
Pipettiere 5 μL des Markers in das mit einer Leiter gekennzeichnete und in jedes der 11 Probenwells. Lass keine Wells leer, um einen ordnungsgemäßen Lauf des Chips zu ermöglichen. Füge 5 μL Marker + 1 μL deionisiertes Wasser zu jedem ungenutzten Probenwell hinzu.

Musterladen

1. Wärme-Denaturierung Ihrer Probe bei 70 °C für 2 Minuten vor dem Laden auf den Chip.
Pipettiere 1 μL der Leiter in das mit dem Leiter-Symbol gekennzeichnete Loch.
Pipettiere 1 μL jeder Probe in jede der 11 Probenvertiefungen.
4. Legen Sie den Chip horizontal in den Adapter des Vortex-Mixers und vortexen Sie 60 Sekunden lang bei 2400 g.
Führen Sie Ihre Probe innerhalb von 5 Minuten mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer durch.

Referenz:

1. Erika D A, Annamaria M, Giulia S, et al. Exosomale MicroRNAs: Umfassende Methoden von der Exosomenisolierung bis zur miRNA-Extraktion und Reinheitsanalyse[M]//MicroRNA-Profiling. Humana, New York, NY, 2023: 75-92.