Prinzipien und Arbeitsablauf der gesamten Exom-Sequenzierung

Was ist WES?

Das Exom wird allgemein definiert als die Gesamtheit aller Exons innerhalb von protein-codierenden Genen, einschließlich Elemente, die nicht protein-codierend sind, wie Sequenzen von Mikro-RNA oder lncRNA. Die Untersuchung des Exoms hilft bei der Identifizierung von Loci, die spezifische Krankheiten auslösen können. Bei der Erforschung seltener mendelscher Erkrankungen erweist sich das Exom-Sequencing als besonders effiziente Methode zur Erkennung genetischer Variationen.

Beschleunigt durch Fortschritte in gezielte Anreicherung Strategien und Durchbrüche in der DNA-Sequenzierungstechnologie, die Evolution von Whole-Exom-Sequenzierung (WES) war entscheidend. WES steht für eine genomische Analysetechnik, die auf die detaillierte Untersuchung aller transkribierbaren Exons innerhalb eines Genoms abzielt. Dies wird durch die Nutzung von DNA erreicht. Mikroarray oder Whole-Genome-Sequenzierung Plattformen in Kombination mit Sequenzfangtechnologien. Diese Werkzeuge ermöglichen die selektive Erfassung und Anreicherung von Exonregionen in der DNA, die anschließend einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen werden, um Einblicke in die regulatorischen Mechanismen der Genexpression zu erhalten.

WES zeigt die Fähigkeit, potenzielle Mutationen zu erkennen, die mit Phänotypen oder Krankheiten in Verbindung stehen könnten, sowie allgemeine genomische Variationen, die Entdeckung neuer Gene und die Beziehungen zwischen Phänotyp und Genotyp. Genmutationen.

Unterschied zwischen WES und WGS

WES umfasst die Extraktion aller exons, der primären Bereiche, die die Proteinproduktion steuern. Proteine bilden den strukturellen und funktionalen Kern des menschlichen Körpers und machen die Exom-Zonen innerhalb der DNA von größtem genetischen Wert. Da Exons lediglich 1 % des Genoms eines Individuums ausmachen, gelingt es WES, die Kosten zu kontrollieren und gleichzeitig die Testtiefe zu erhöhen – ein entscheidender Faktor für die Genauigkeit. Bedeutende akademische Forschungsergebnisse konzentrieren sich derzeit auf den exons Bereich, sodass die aus WES generierten Daten ausreichend substantiell für zukünftige Aktualisierungen sind. Mit dem Aufkommen neuer Forschungsergebnisse kann eine direkte Datenanalyse durchgeführt werden, ohne dass ein erneuter Test erforderlich ist.

Whole Genome Sequenzierung (WGS) bemüht sich, alle genetischen Loci zu erfassen. Bereiche jenseits der Exons, die 99% der gesamten Loci ausmachen, enthalten reichlich repetitive und unsinnige Segmente. Der Ertrag an relevanter wissenschaftlicher Literatur ist ebenfalls auffallend spärlich, was darauf hindeutet, dass der lesbare Inhalt, der aus WGS gewonnen wird, nahezu ununterscheidbar von dem aus WES extrahierten Inhalt ist. Dennoch werden erhebliche Kosten unverhältnismäßig für 'sinnlose' Loci in WGS verschwendet, was es schwierig macht, eine Sequenzierungstiefe zu garantieren. Bei bestimmten WGS genetischen Tests, die mehrere Tausend kosten, beträgt die durchschnittliche Tiefe lediglich 30X. Für die analysierten Loci könnte die Sequenzierungstiefe auf einstellige Werte sinken, was die Daten praktisch wertlos für Referenzzwecke macht.

Im Vergleich zu WGS bietet WES in den folgenden drei Aspekten einen Vorteil:

• Die WES benötigt weniger Zeit als die WGS.
• Die von WES generierten Datensätze sind erheblich kleiner als die von WGS, was sie für bioinformatische Analysen handhabbarer macht.
• Kosten: Die Kosten für WGS liegen drei- bis viermal höher als die für WES.

Daher wird WES derzeit als die kosteneffektivste Gen-Testtechnik angesehen.

Prinzip der Exom-Sequenzierung

Whole Exom Sequenzierung als genomische Analysetechnik sucht nach genetischen Mutationen, die mit Variationen in der Proteinfunktion verbunden sind. Das grundlegende Prinzip umfasst:

DNA-Erfassung und -Anreicherung: DNA- oder RNA-Sonden, die spezifisch für Exonregionen sind, werden zunächst verwendet, um DNA-Sequenzen zu erfassen und anzureichern. Typischerweise wird dies durch die Hybridisierungstechnologie in flüssiger Phase erreicht, die die Prinzipien der Basenpaarung nutzt, um biotinmarkierte RNA-Sonden mit DNA-Bibliotheken mit Adaptersequenzen zu hybridisieren und dann die DNA des Zielbereichs durch Bindung an magnetische Perlen anzureichern.

Hochdurchsatz-Sequenzierung: Die angereicherten DNA-Sequenzen werden dann mittels Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie sequenziert. Sequenzierung ist der Prozess, alle Desoxyribonukleotid-Anordnungen im Exom zu entdecken, was uns helfen kann, potenzielle pathophysiologische Veränderungen bei bestimmten Krankheiten zu verstehen.

Datenanalyse: Die Sequenzierungsergebnisse werden einer bioinformatischen Analyse unterzogen, um genetische Mutationen zu identifizieren, die mit Variationen der Proteinfunktion verbunden sind.

Allgemeiner Arbeitsablauf der Exom-Sequenzierung

Der konventionelle Arbeitsprozess von Whole Exom-Sequenzierung (WES) umfasst die Probenvorbereitung, das Exom-Capturing und das Bibliotheksdesign, Zielanreicherung, Sequenzierung und bioinformatische Analyse. Eine Abbildung, die den WES-Workflow veranschaulicht, kann unten dargestellt werden.

Abbildung 1. Arbeitsablauf der WGS.

Hinweis: Die genauen Protokolle variieren je nach Art der Proben, Reagenz-Kits und Sequenziergeräten. Forscher sollten die für die verwendeten Reagenzien, Kits und Sequenziermaschinen angegebenen Anweisungen befolgen.

Probenvorbereitung: Vollblutproben, periphere Blutmononukleäre Zellen (PBMCs), frisch gefrorene Gewebe, formalinfixierte, paraffineingebettete (FFPE) Proben, Plasma-Proben und Zellen aus Fruchtwasser können unter anderem für die Exomsequenzierung verwendet werden. DNA wird aus den biologischen Proben, die getestet werden sollen, extrahiert und durch physikalische Methoden oder enzymatische Prozesse fragmentiert. Physikalische Zerstörung umfasst Scherung, Sonikation und fluiddynamische Scherung, wobei Scherung und Sonikation die primären Methoden der DNA-Fragmentierung darstellen. Enzymatische Prozesse beinhalten typischerweise den Einsatz von Nukleasen oder Transposasen, die die DNA in kleinere Stücke fragmentieren. Nukleasen führen zur Spaltung der Phosphodiesterbindungen innerhalb der Nukleinsäuren, was zu einer DNA-Fragmentierung führt.

Erfassung und Anreicherung von Exonen: Während der Exomfängung und -anreicherung werden Exons selektiv unter Verwendung von Exomfängentechnologie angereichert. Das grundlegende Konzept hinter der Zielanreicherung besteht darin, die physikochemischen Unterschiede zwischen der Zielverbindung und anderen Substanzen auszunutzen, um deren Trennung zu erleichtern. Nach der Isolierung des Exoms vom Rest des Genoms sind mehrere Waschschritte erforderlich, um ein reineres Exom zu erhalten. Obwohl in der Regel destilliertes Wasser verwendet wird, um die Ziele zu eluieren, können bestimmte spezialisierte Kits spezifische Elutionslösungen erfordern.

Bibliothekskonstruktion: Die Bibliothekskonstruktion umfasst die Reparatur der Enden der angereicherten exonspezifischen DNA-Fragmente, das Anbringen von Verbindern und die Amplifikation der Bibliotheken, um die angereicherten exonspezifischen DNA-Fragmente in Sequenzierungsbibliotheken umzuwandeln – ein Schritt, der reichlich DNA-Vorlagen für die anschließende Sequenzierung bereitstellt.

Tabelle 1. Häufige Kits zur Zielanreicherung für die Sequenzierung.

Sequenzierung: Mit den Fortschritten in den Sequenzierungstechniken wird die Next-Generation Sequencing (NGS) umfassender für die Exomsequenzierung eingesetzt. Der Grundgedanke hinter NGS besteht darin, die Exomprobe mit einer geeigneten Basis (wie einem Flowcell bei Illumina Hiseq und magnetischen Perlen bei Roche-454) zu koppeln, gefolgt von einer in situ PCR-Duplikation, um die Signalverstärkung in jeder Runde sicherzustellen. Die ddNTP werden nach jeder Erweiterungsrunde untersucht, und die vollständige Sequenz wird schließlich mit einem bioinformatischen Algorithmus zusammengestellt. Die hohe Effizienz und Durchsatzkapazität machen NGS zu einer attraktiven Option für die Hochdurchsatzsequenzierung.

Neben NGS entwickeln sich die Sequenzierungstechnologien der dritten Generation schnell weiter und bieten Effizienzen, die NGS bei weitem übertreffen. Die Einzelmolekülsequenzierung, ein charakteristisches Merkmal der Sequenzierung der dritten Generation, kann die Zeit und die Kosten für die Ganzgenomsequenzierung auf nur wenige Minuten reduzieren. Unternehmen wie PacificBio und Oxford Nanopore haben die Effizienz ihrer Methoden demonstriert, die potenziell eine Revolution im Bereich der Exomsequenzierung auslösen könnten.

Tabelle 2. Häufig verwendete Methoden für das Sequenzieren heutzutage.

Datenanalyse: Der Datenanalyseprozess umfasst die Eliminierung von niedrigqualitativen Reads während der Sequenzierung durch Qualitätskontrolle, das Ausrichten von hochqualitativen Reads an das Referenzgenom, die Quantifizierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), Insertionen und Deletionen (Indels) sowie von Kopienzahlvariationen (CNVs), gefolgt von Annotation, Screening, Analyse und Validierung. Die Datenanalyse stellt einen kritischen Punkt in der Exom-Sequenzierung dar und umfasst die Bewertung und Verarbeitung der Sequenzierungsdatenqualität, das Ausrichten der Sequenzierungsreads an das Referenzgenom und die Identifizierung genetischer Mutationen innerhalb der Proben. Die erkannten genetischen Mutationen müssen annotiert werden, einschließlich der Erkennung der Funktion der Mutation, ihrer pathologischen Bedeutung und ihrer potenziellen Auswirkungen.

Abbildung 2. Die typische Pipeline zur Variantenbestimmung.

Vorteile der Exom-Sequenzierung

Kosten-Nutzen-Verhältnis: Im Vergleich zu Whole-Genome-Sequenzierung, Whole Exome Sequenzierung bietet eine tiefere Abdeckung, größere Genauigkeit und ist wirtschaftlicher effizient.

Hohe Sequenzierungstiefe: Die Sequenzierungstiefe kann mehr als 120x erreichen.

Hoher Durchsatz: Es erfüllt die Forschungsbedürfnisse mehrerer Zielregionen aus einer großen Anzahl von Proben.

Hohe Genauigkeit: Mit einer tiefen Sequenzierungsabdeckung ist die Datenqualität hoch und effizient.

Anwendung der Exom-Sequenzierung

Whole-Exom-Sequenzierung (WES) findet Anwendung in verschiedenen Bereichen der biomedizinischen Forschung, einschließlich der Untersuchung von monogenen erbliche Krankheitenkomplexe Krankheiten, somatische Mutationen in Tumoren, Entdeckung von Onkogenen und Tumorsuppressorgenen sowie Fortschritte bei Initiativen zur personalisierten Medizin.

Tumoren, die komplexe Krankheiten sind, die durch multiple Genmutationen ausgelöst werden, können effektiv mit Hilfe von verstanden werden. Whole-Exom-SequenzierungEs ermöglicht Wissenschaftlern und Klinikern, Variationen in tumorbezogenen Genen aufzudecken, um eine genaue Diagnose und Prognose des Tumors zu erreichen. Dies umfasst hauptsächlich die Forschung zu Treibergen, die molekulare Subtypisierung von Tumoren, die Forschung zu wiederkehrenden Metastasen und maßgeschneiderte Medikamente für individuelle Tumoren.

Genetische Störungen entstehen häufig aus Genmutationen, die oft in den exonspezifischen Regionen auftreten, die Proteine kodieren. Traditionelle Methoden zur Mutationsdetektion erfordern eine gründliche Untersuchung von krankheitsrelevanten Genen, jeweils einzeln, was zeitaufwendig, arbeitsintensiv ist und eine erhebliche Stichprobengröße erfordert. Exom-Sequenzierung mildert jedoch diese Nachteile, indem sie gleichzeitig mehrere Krankheitsgene untersucht, was zu einer signifikanten Verbesserung der Detektionseffizienz und -genauigkeit führt. Durch die Anwendung von WES können wir alle exonspezifischen Regionen sequenzieren, die erforderlich sind, um Proteine zu kodieren, und anschließend Genmutationen oder polymorphe Loci identifizieren, die mit dem Ausbruch der Krankheit in Verbindung stehen. Dies erleichtert die genaue Diagnose und Behandlung genetischer Störungen.

Abbildung 3. WES und die Auswirkungen seiner genetischen Konsequenzen auf die öffentliche Gesundheit des Menschen. (Rabbani B et al., 2014)

WES weckt erhebliches Interesse für klinische Anwendungen, da es die handlungsrelevanten Bereiche innerhalb eines Genoms umfasst. Das Hauptziel besteht darin, Variationen in den exonen Regionen zu identifizieren und die ursächlichen Mutationen für Krankheiten oder pathogene Varianten zu bestimmen. Die Schnittstelle zwischen Big-Data-Analyse und WES treibt Fortschritte in der personalisierten Medizin in zahlreichen Dimensionen voran.

Wenn Sie an unseren Genomik-Dienstleistungen interessiert sind, zögern Sie bitte nicht, unsere Wissenschaftler zu kontaktieren. Wir helfen Ihnen gerne weiter. Zusätzlich zu Genomsequenzierung, bieten wir auch Dienstleistungen an, die umfassen Transkriptomik, Epigenomik, mikrobielle Genomik, und PacBio SMRT-Sequenzierung.

Referenzen:

1. Warr A, Robert C, Hume D, et al. Exom-Sequenzierung: aktuelle und zukünftige Perspektiven. G3: Gene, Genome, Genetik, 2015, 5(8): 1543-1550.
2. Rabbani B, Tekin M, Mahdieh N. Das Versprechen der Whole-Exome-Sequenzierung in der medizinischen Genetik. Zeitschrift für Humangenetik, 2014, 59(1): 5-15.
3. Suwinski P, Ong C, Ling MHT, et al. Fortschritte in der personalisierten Medizin durch die Anwendung von Whole-Exome-Sequenzierung und Big-Data-Analytik. Grenzen der Genetik, 2019, 10:49.
4. Shashi V, McConkie-Rosell A, Schoch K, et al. Praktische Überlegungen zur klinischen Anwendung von Whole-Exome-Sequenzierung. Klinische Genetik, 2016, 89(2): 173-181.
5. Goh G, Choi M. Anwendung der gesamten Exomsequenzierung zur Identifizierung krankheitsverursachender Varianten bei erblichen menschlichen Krankheiten. Genomik & Informatik, 2012, 10(4): 214.
6. Albertsen H M, Matalliotaki C, Matalliotakis M, et al. Die gesamte Exomsequenzierung identifiziert hemizygote Deletionen in den Genen UGT2B28 und USP17L2 in einer dreigenerationen Familie mit Endometriose. Molekulare Medizin Berichte, 2019, 19(3): 1716-1720.
7. Erjavec S O, Gelfman S, Abdelaziz A R, et al. Die gesamte Exomsequenzierung bei Alopecia Areata identifiziert seltene Varianten in KRT82. Naturkommunikationen, 2022, 13(1): 800.
8. Luo W, Zhang C, Jiang Y, et al. Systematische Rekonstruktion der Biologie des Autismus aus massiven genetischen Mutationsprofilen. Die Wissenschaft schreitet voran., 2018, 4(4): e1701799.