Aktuelle Techniken zur gezielten Anreicherung von Regionen

Was ist gezielte Regionssequenzierung?

Während Whole-Genome-Sequenzierung deckt das gesamte Genom eines Organismus ab, gezielte Regionssequenzierung bestimmt die Reihenfolge der Nukleotide in den interessierenden Regionen. Durch gezielte Genomsequenzierung können SNPs, Indels, CNVs und große SVs auf eine hochsensitive und spezifische Weise nachgewiesen werden. Im Vergleich zur gesamten Genomsequenzierung ist die gezielte Genomsequenzierung fokussierter, wirtschaftlicher und effektiver. Darüber hinaus können gezielte Regionen mit einer viel höheren Tiefe und zu geringeren Kosten sequenziert werden, was zur Entdeckung seltener Variationen beiträgt. Die gesamte Exomsequenzierung ist ein Beispiel für gezielte Genomsequenzierung, da sie sich auf die Exons konzentriert. Und mit einem gezielten oder „Hot-Spot“-Panel können wir eine Reihe von interessierenden Genen sequenzieren. Diese Gene können Mutationen aufweisen, die mit der Pathogenese von Krankheiten assoziiert sind, oder es handelt sich um klinisch relevante Gene von Interesse. Dies wurde in der biologischen und medizinischen Forschung sowie in der klinischen Versorgung angewendet. Hier diskutieren wir hauptsächlich die aktuellen Techniken zur Zielanreicherung und empfehlen qualifizierte Produkte.

Klassische Techniken zur gezielten Anreicherung

Die Zielanreicherung erleichtert erheblich die Entwicklung von gezieltem Regionssequenzieren und macht das Sequenzieren für komplexe Genome erschwinglich und effizient. Es gibt drei klassische Strategien für die gezielte Anreicherung (Abbildung 1).

Abbildung 1. Strategien zur gezielten Anreicherung (Mertes u. a.. 2011). 1) Hybridisierung entweder auf Mikroarrays (a) oder in Lösung (b). 2) Anreicherung durch MIPs (a) oder Selektor-Sonden (b). 3) Anreicherung durch typische PCR (a), Multiplex-PCR-Assay (b) und RainDance-Mikrotröpfchen-PCR mit bis zu 20.000 Primerpaaren (c).

• Hybride Erfassung

Die Fragmentbibliothek für Shotgun-Sequenzierung ist vorbereitet, um mit einer Bibliothek zu hybridisieren, die DNA-Fragmente enthält, die komplementär zu den Zielregionen sind. Dies kann auf Mikroarrays oder in Lösungen durchgeführt werden. Mamanova u. a.(2010) stellte fest, dass bei kleinen Zielgrößen (ungefähr 3,5 Mb) die Lösungserfassung eine überlegene Abdeckung der Zielregionen im Vergleich zu ansatzbasierten Methoden bietet und dass beide Ansätze bei der Anreicherung des gesamten Exoms gleichwertig abschneiden. Wir empfehlen SureSelect (Agilent Technologies), Nextera (Illumina), TruSeq (Illumina) und SeqCap EZ (Roche NimbleGen) für die zielgerichtete Anreicherung auf Basis der Hybridisierung in Lösung.

• Selektive Zirkularisierung

Molekulare Inversionssonden (MIPs) bestehen aus einer gemeinsamen Sequenz, die von ziel-spezifischen Sequenzen flankiert wird. Nach der Hybridisierung an die interessierenden Regionen wird MIP einer Lückenfüllreaktion und Ligation unterzogen, um geschlossene Kreise zu erzeugen. Die MIPs können an mechanisch geschertem DNA hybridisiert werden, während Selektor-Sonden ein Restriktionsenzym-Cocktail verwenden, um die DNA zu verdauen, und die Sonden an das Restriktionsmuster angepasst sind. MIPs und Selektoren bestehen aus einem gemeinsamen zentralen Linker, in den der Sequenzierungsprimer für NGS integriert werden kann. Daher ist der Aufbau der NGS-Bibliothek nicht erforderlich. Wir empfehlen HaloPlex (Agilent Technologies) für die selektive zirkularisierungsbasierte Zielanreicherung.

• PCR-Amplifikation

PCR wird verwendet, um Interessensregionen zu bereichern, indem mehrere Langstrecken-PCRs parallel, Multiplex-PCRs und Mikrotropfen-PCRs durchgeführt werden. Es gibt viele verfügbare Produkte für Langstrecken-PCR, darunter SequalPrep (Thermo Fisher Scientific) und SeqTarget (Qiagen), Ion Ampliseq basierend auf hochmultiplexen PCR und die Mikrotropfentechnologie von RainDance.

Die Vergleiche klassischer Zielanreicherungsverfahren

Die vier Strategien haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. Zum Beispiel übersteigt die Spezifität von PCR die der Hybridfängertechnologie, aber ihre Einheitlichkeit wird weder von MIPs noch von der Hybridfängertechnologie erreicht. Für Aktualisierungen der Protokolle können Sie diese Website besuchen: ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pulldown/.

Tabelle 1. Vergleiche von Zielanreicherungsmethoden. Adaptierte von Dapprich u. a.. (2016).

Fortgeschrittene Methode: Regionenspezifische Extraktion (RSE)

Die traditionellen Methoden basieren stark auf der Fragmentierung von DNA vor der Amplifikation, was relativ kurze Sequenzen (weniger als 1 kb) erzeugt. Dies ist ein begrenzender Faktor für die Charakterisierung komplexer genomischer Loci, da sie keine großen Fragmente liefern können, die verwirrende Sequenzelemente überbrücken. Glücklicherweise wurde die Anreicherungsmethode - Region Specific Extraction (RSE), vorgeschlagen von Dapprich. u. a.. (2016) spricht dieses unerfüllte Bedürfnis an, indem es lange DNA-Fragmente (ungefähr 20 kb) erfasst.

Das Prinzip der RSE ist in Abbildung 2 skizziert. Kurz gesagt, wird die genomische DNA denaturiert, um mit Fang-Primer hybridisiert zu werden. Die gebundenen Primer werden dann enzymatisch mit inkorporierten biotinylierte-dNTPs verlängert. Die zielgerichteten DNA-Segmente werden durch streptavidin-beschichtete magnetische Partikel ausgefällt. Die gefangene DNA kann durch die Amplifikation des gesamten Genoms amplifiziert und anschließend durch Next-Generation-Sequencing verarbeitet werden.

Abbildung 2. Prinzip des RSE.

Metriken zur Bewertung eines Zielanreicherungsversuchs

Es gibt mehrere Metriken, die in Zielanreicherungs-Experimenten berücksichtigt werden müssen. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein universelles Set von Zielanreicherungs-Sequenzierungsbeschreibungen (TESD) entwickelt, das die Bewertung der Ergebnisse der Zielanreicherung ermöglicht. Die TESD verwendet die folgenden Parameter:

1. Region of Interest, ROI
2. Durchschnittliche Lesetiefe im Bereich der Lesevorgänge, D_ROI
3. Spezifität, S
4. Anreicherungsfaktor, EF
5. Gleichmäßigkeit, E
6. Gewicht der erforderlichen Eingangs-DNA, W
7. Fraktion ausreichend abgedeckt bei einer Lesetiefe von x, F_x

Von den sieben Kennzahlen bestimmen ROI und W den Eingabebedarf, während die anderen fünf einen messbaren Bericht entweder über die Anreicherung (S, EF, E) oder über die Sequenzierungsergebnisse (D) liefern._ROI, F_x).

Wenn Sie an unseren Genomik-Dienstleistungen interessiert sind, besuchen Sie bitte unsere Website: www.cd-genomics.com für weitere Informationen. Wir können ein vollständiges Paket von Genomsequenzierungeinschließlich Whole-Genome-Sequenzierung, Whole-Exom-Sequenzierung, gezielte Regionssequenzierung, mitochondriale DNA (mtDNA) Sequenzierungund vollständige Plasmid-DNA-Sequenzierung.

Referenzen:

1. Dapprich J, Ferriola D, Mackiewicz K, u. a.Die nächste Generation von Zielerfassungstechnologien - die Anreicherung und Sequenzierung großer DNA-Fragmente bestimmt regionale genomische Variationen hoher Komplexität. BMC Genomics, 2016, 17(1): 486.
2. Mamanova L, Coffey A J, Scott C E, u. a.Zielanreicherungsstrategien für die Next-Generation-Sequenzierung. Naturmethoden, 2010, 7(2): 111.
3. Mertes F, ElSharawy A, Sauer S, u. a.Gezielte Anreicherung von genomischen DNA-Regionen für die Next-Generation-Sequenzierung. Briefings in funktioneller Genomik, 2011, 10(6): 374-386.
4. McGinn S, Bauer D, Brefort T, u. a.Neue Technologien zur DNA-Analyse – eine Übersicht über das READNA-Projekt. Neue Biotechnologie, 2016, 33(3): 311-330.
5. Ballester, L. Y., Luthra, R., Kanagal-Shamanna, R., u. a. Fortschritte in der klinischen Next-Generation-Sequenzierung: Zielanreicherung und Sequenzierungstechnologien. Expertenbewertung der Molekulardiagnostik, 2016, 16(3), 357–372. doi:10.1586/14737159.2016.1133298