Sequenzierungsprimer

Was ist ein Sequenzierungsprimer?

Sequenzierungsprimer sind kurze DNA-Oligonukleotide, die in DNA-Sequenzierungsmethoden verwendet werden. Diese Primer bieten einen Ausgangspunkt für die DNA-Synthese während der Sequenzierungsreaktion.

Sequenzierungsprimer in der Sanger-Sequenzierung

In Sanger-Sequenzierung, das auch als Kettenabbruch-Sequenzierung bekannt ist, werden Sequenzierungsprimer verwendet, um die DNA-Synthese in einem DNA-Template-Molekül zu initiieren. Diese Primer sind komplementär zu einem spezifischen Bereich des DNA-Templates, der sequenziert werden muss. Die Sequenzierungsreaktion umfasst die Einfügung von fluoreszenzmarkierten Dideoxynukleotiden (ddNTPs) in den wachsenden DNA-Strang, was die Kettenverlängerung an jeder Position beendet und eine Reihe von Fragmenten unterschiedlicher Längen erzeugt. Diese Fragmente werden dann nach Größe mittels Kapillarelektrophorese getrennt, und die Sequenz wird basierend auf der Reihenfolge der abgebrochenen Fragmente bestimmt.

Sequenzierungsprimers in der NGS

In Next-Generation-Sequenzierung Techniken wie die Illumina-Sequenzierung verwenden ebenfalls Sequenzierungsprimer, um die DNA-Synthese zu initiieren. Der Sequenzierungsprozess unterscheidet sich jedoch von der Sanger-Sequenzierung. NGS-Plattformen nutzen massiv parallele Sequenzierung, bei der viele Sequenzierungsreaktionen gleichzeitig in einem hochgradigen Durchsatz durchgeführt werden. Sequenzierungsprimer in NGS-Methoden enthalten typischerweise Adaptersequenzen, die für die Anheftung der DNA-Fragmente an die feste Oberfläche oder die Flusszelle der Sequenzierungsplattform erforderlich sind. Diese Adapter erleichtern die Amplifikation und Sequenzierung der DNA-Fragmente auf massiv parallele Weise und erzeugen Millionen von kurzen DNA-Sequenzen in einem einzigen Sequenzierungslauf.

Was sind die Prinzipien des Designs von Sequenzierungsprimern?

Sequenzierungsprimer werden oft in universelle Vektor-Sequenzierungsprimer und gen-spezifische Sequenzierungsprimer unterteilt:

Plasmidvektor universelle Sequenzierungsprimer

Beide Enden des MCS (polykolonaler Bereich) und dann einfach die Sequenzierungsprimer an den Positionen der Enden des Fragments einsetzen, das heißt, die Primer, die gemäß der Vektorsequenz entworfen wurden. Allgemeine Sequenzierungsunternehmen haben einen Teil kostenloser universeller Primer, die verwendet werden können; diese Primer sind einige gängige. kommerzielle Vektoren verwendete Sequenzierungsprimerwie den pCDNA3.1-Vektor oder den pGL3-Basic-Vektor und natürlich andere Vektoren.

Allgemeine Anforderungen an Vektor-Universal-Spezifitätsprimer:

(1) Spezifität: erfordert nur eine Bindungsstelle für die Vektorsequenz;

(2) Position: Es sind mindestens 100 Basen vom eingefügten Fragment erforderlich, zu nah kann zu ungenauer Sequenzierung an beiden Enden des eingefügten Fragments führen.

(3) Länge: 17 bis 25 Basen sind ausreichend

(4) GC-Gehalt: keine besonderen Anforderungen, versuchen Sie, über 35% zu liegen.

(5) Tm-Wert: keine besonderen Anforderungen, versuchen Sie, über 40 zu liegen.

(6) Syntheseanforderungen: vorzugsweise PAGE-Reinigung, Entsalzung ist ebenfalls möglich, ich verwende selbst entsalzte Primer ohne Probleme.

Gen-spezifische Sequenzierungsprimers

Generell müssen wir entwerfen, wenn die Länge des eingefügten Fragments 1500 bp überschreitet. gen-spezifische Sequenzierung Primer, wie viele müssen entworfen werden, um einfach gemäß einem Sequenzierungsprimer eine effektive Leselänge von 700 bp zu erreichen, wie zum Beispiel das eingefügte Fragment von 2500 bp, dann mindestens vier Sequenzierungsprimer, zwei universelle Sequenzierungsprimer, zwei genspezifische Sequenzierungsprimer.

Allgemeine Anforderungen an gen-spezifische Sequenzierungsprimer:

(1) Spezifität: Bindung an die Sequenzvorlage, ohne mehr als 4 Basenfehlpaarungen.

(2) Position: Wenn mehr als ein Primer entworfen werden muss, ist es erforderlich, dass die Überlappung zwischen der Sequenzierungslänge des vorherigen Primers und dem nächsten Sequenzierungsprimer mindestens 100 Basen beträgt, andernfalls können die beiden Sequenzierungsprimer nicht überlappen, und der Sequenzierungsprimer muss erneut entworfen werden. Das gilt aus demselben Grund für universelle Vektorprimer und gen-spezifische Primer.

(3) Länge: 17-25 Basen

(4) GC-Gehalt: keine besonderen Anforderungen, versuchen Sie, über 35% zu liegen.

(5) Tm-Wert: keine besonderen Anforderungen, versuchen Sie, über 40 zu liegen.

(6) Syntheseanforderungen: vorzugsweise PAGE-Reinigung, Entsalzung ist ebenfalls möglich.

Primerdesign für die Sanger-Sequenzierung

In Sanger-Sequenzierung Experimente zeigen, dass die meisten PCR-Primer als Sequenzierungsprimer für Sequenzierungsreaktionen verwendet werden können, aber einige PCR-Primer können nicht für Sequenzierungsreaktionen verwendet werden, hauptsächlich aus den folgenden Gründen:

(1) Einfache Primer: Einfache Primer haben oft mehrere Bindungsstellen auf der Sequenzierungsvorlage, was die Sequenzierungsergebnisse direkt beeinflusst.

(2) Zufällige Primer: Zufällige Primer (wie RAPD-Primer) sind in der Regel kurz, und die verwendete Annealing-Temperatur ist niedrig, was eine gute Bindung an die Vorlage unter den Bedingungen der Sequenzierungsreaktion verhindert.

(3) Primer mit zu langen Fragmenten: Im Allgemeinen dürfen Sequenzierungsprimer nicht länger als 24 bp sein, und zu lange Primer neigen dazu, an mehreren Bindungsstellen auf dem Sequenzierungstemplate unter den niedrigeren Sequenzierungsreaktionsbedingungen zu binden, was zu höherem Rauschen führt; außerdem wird die Reinheit längerer Primer ebenfalls schwer zu gewährleisten sein. Üblicherweise sollte die Reinheit der für die Sequenzierung verwendeten Primer über 90 % liegen, und wenn die Reinheit der Primer niedrig ist, wird das Hintergrundsignal der Sequenzierungsreaktion erheblich höher sein, was die Genauigkeit der Sequenzierungsergebnisse direkt beeinträchtigt.

(4) Speziell gekennzeichnete Primer: Alle vier Basen in der Sanger-Sequenzierungsreaktion sind fluoreszenzmarkiert, und fluoreszenzmarkierte Primer, die in der Sequenzierungsreaktion verwendet werden, erzeugen Störungen im Fluoreszenzsignal; außerdem sind Primer, die mit anderen Arten von Makromolekülen gekennzeichnet sind, ebenfalls ungeeignet für Sequenzierungsreaktionen, da die an den Primern markierten Makromolekülgruppen die Mobilität der DNA-Fragmente direkt beeinflussen und zu einer schlechten oder falschen Peakform der Sequenzierungsergebnisse führen.

(5) Primer mit niedriger Reinheit: Sequenzierungsprimer haben hohe Anforderungen an die Reinheit, und gemischte Fremdstoffe in synthetischen Primern können zu erhöhtem Rauschen führen, was die Sequenzierungsqualität direkt beeinträchtigt.

Primerauswahl bei der 16S/18S/ITS-Sequenzierung

Verschiedene Bakterienarten haben die gleiche konservierte Regionssequenz und unterschiedliche variable Regionssequenzen. Primer können entworfen werden, um alle zu amplifizieren. bakterielle 16SrRNA-Gene in Umweltproben basierend auf den Sequenzen der konservierten Regionen, während verschiedene Bakterienarten anhand der Sequenzen der variablen Regionen unterschieden werden können.

Die am häufigsten verwendeten Primer in traditionellen Methoden sind 27F und 1492R, die fast die gesamte Länge des vollständigen 16SrRNA-Gens amplifizieren können, was aufgrund der aktuellen Lese-längenbeschränkung von NGS nicht für Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen anwendbar ist, jedoch weit verbreitet für die molekulare Identifizierung reiner Bakterien verwendet wird. Angesichts der aktuellen Lese-längenbeschränkung der gängigen Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen kann nur ein bestimmter variabler Bereich des 16SrDNA sequenziert werden. Einige wählen die Sequenzierung eines einzelnen V-Bereichs (V3/V4/V6), andere einen doppelten V-Bereich (V3-V4-Bereich oder V4-V5-Bereich), und einige entscheiden sich für einen dreifachen V-Bereich (V1-V3-Bereich, V5-V7-Bereich oder V7-V9-Bereich) für die 16S rDNA-Sequenzierung in der Literatur.

Im Allgemeinen sind die häufig verwendeten und anerkannten Sequenzierungsregionen für unsere Umwelt-Mikrobiomik V3-V4, V4-V5 oder allein die V4-Region. Viele 16S-Sequenzierungsprimer sind im Earth Microbiome Project dokumentiert, einschließlich der traditionellen 515F/806R-Primer und optimierter 515F/806R-Primersequenzen.

Primer in 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. (Abellan-Schneyder et al., 2021)

Ähnlich sind 18S rRNA-Gene DNA-Sequenzen, die kleine Untereinheiten von eukaryotischen Ribosomen kodieren und sowohl konservierte als auch variable Regionen (V1-V9, ohne V6-Region) aufweisen. Die konservierten Regionen spiegeln die Affinitäten zwischen biologischen Arten wider, während die variablen Regionen die Unterschiede zwischen den Arten reflektieren und sich als taxonomische Kriterien auf Art- und höherer Ebene eignen. V4 ist die am häufigsten verwendete Wahl für die Annotation der 18S rRNA-Genanalyse, da sie die vollständigsten Datenbankinformationen und die beste Klassifikation bietet. Bei Pilzen sind die 5.8S-, 18S- und 28S-rRNA-Gene hochgradig konserviert, während ITS aufgrund des geringeren Drucks durch natürliche Selektion und der Fähigkeit, während der Evolution mehr Variation zu tolerieren, eine extrem breite Sequenzpolymorphie in der überwiegenden Mehrheit der Eukaryoten zeigt. Gleichzeitig zeigt der konservierte Typ von ITS innerhalb der Arten relativ konsistente Merkmale und deutlichere Unterschiede zwischen den Arten, die die Unterschiede zwischen Gattungen und sogar Stämmen widerspiegeln können. Die ITS-Sequenzfragmente sind klein (350 bp und 400 bp für ITS 1 und ITS 2) und leicht zu analysieren und wurden in der phylogenetischen Analyse verschiedener Pilzarten weit verbreitet eingesetzt.

Archaebakterien, auch bekannt als Archaea, sind eine ganz besondere Klasse von Bakterien, die einige Eigenschaften sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten aufweisen. Studien haben gezeigt, dass die Primerpaare 519F/915R und 344F/915R die beste Spezifität für Archaebakterien haben. Es gibt eine Präferenz für Primerpaare, die an verschiedene Plattformen angepasst sind, und für die Illumina MiSeq 2×300 bp Sequenzierungsplattform ist der Primer 519F/915R am geeignetsten (16S V4V5-Region).

Referenz:

1. Abellan-Schneyder, Isabel, et al. "Primer, Pipelines, Parameter: Probleme bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung." Msphäre 6.1 (2021): e01202-20.