ITS Amplicon-Sequenzierung: Technik, Workflow und Pilzanwendungen

Pilze spielen eine entscheidende Rolle in Ökosystemen und der menschlichen Gesundheit, dennoch ist die traditionelle Identifikationsmethoden—die auf Kultivierung und morphologischer Beobachtung angewiesen sind—versagen oft darin, "unkultivierbare Mikroorganismen" zu erkennen, und haben Schwierigkeiten, eng verwandte Arten genau zu klassifizieren. ITS Amplicon-SequenzierungDie gezielte Analyse des Internen Transkribierten Spacers (ITS) der ribosomalen DNA (rDNA) von Pilzen und die Nutzung von Hochdurchsatz-Sequenzierung ermöglichen eine schnelle, kultivierungsfreie Analyse von Pilzgemeinschaften auf Arten-/Unterartenebene und setzen somit den globalen Standard.

Dieser Artikel untersucht die biologischen Eigenschaften der ITS-Region, skizziert den gesamten Arbeitsablauf von der Probenentnahme bis zur Datenanalyse und demonstriert deren Anwendungen anhand landwirtschaftlicher, medizinischer und industrieller Fallstudien. Wir vergleichen führende analytische Software-Tools, schlagen einen standardisierten Rahmen für die Dateninterpretation vor und erörtern das Potenzial der Sequenzierung der dritten Generation und der KI zur Förderung der Pilzforschung, wobei wir betonen, wie die Integration von Multi-Omics ganzheitliche Pilzstudien vorantreiben wird.

Was ist ITS-Amplicon-Sequenzierung?

Pilze, als unverzichtbare Zersetzer und Symbionten in Ökosystemen, beeinflussen direkt die Effizienz des Kohlenstoffkreislaufs, die Bodenfruchtbarkeit und die Pflanzen Gesundheit. In der menschlichen Gesundheit fungieren sie als wichtige industrielle Organismen (z. B. Hefe) und pathogene Erreger (z. B. Candida, Aspergillus). Traditionelle Methoden zur Identifizierung von Pilzen, die auf Morphologie und Kultivierung basieren, stehen jedoch vor zwei kritischen Einschränkungen:

• Unkultivierbare Arten blinder FleckDie meisten Pilze können nicht durch reine Kulturen isoliert werden, was zu einer Untererfassung führt. Beispielsweise erfassen Bodenstudien mit traditionellen Ansätzen nur 1–5% der Pilzvielfalt, obwohl zehntausende Arten vorhanden sind.
• Morphologische MehrdeutigkeitEng verwandte Arten weisen ähnliche Merkmale auf, was die Klassifizierung auf Arten- oder Unterartenebene erschwert.

Diese Engpässe verdeutlichen den dringenden Bedarf an hochdurchsatzfähigen, hochpräzisen molekularen Werkzeugen.

Der revolutionäre Durchbruch der ITS-Amplikon-Sequenzierung

Die ITS-Amplicon-Sequenzierung revolutioniert die Forschung zu Pilzgemeinschaften, indem sie die ITS1- und ITS2-Regionen innerhalb der rDNA von Pilzen anvisiert. In Kombination mit Hochdurchsatz-Sequenzierungsplattformen bietet sie drei wesentliche Vorteile:

• Anbau-freiDie DNA-Extraktion direkt aus Umweltproben ermöglicht die Detektion aller Pilze, einschließlich nicht kultivierbarer Arten.
• Artenebene AuflösungUnterscheidet eng verwandte Taxa und schließt Klassifikationslücken, die von traditionellen Methoden hinterlassen wurden.
• SkalierbarkeitVerarbeitet Hunderte von Proben pro Durchlauf und identifiziert Tausende von operationalen taxonomischen Einheiten (OTUs).

Heute ist diese Technik der Goldstandard für die Analyse von Pilzgemeinschaften und wird in der Umweltwissenschaft, Agroökologie und medizinischen Mikrobiologie angewendet.

Detaillierte Erklärung der ITS-Amplicon-Sequenzierungstechnologie

Die ITS-Region dient aufgrund ihrer einzigartigen Sequenzvariationen als "molekularer Fingerabdruck" für die Klassifizierung von Pilzen, während der Amplicon-Sequenzierungs-Workflow die Abläufe standardisiert, um diesen molekularen Marker in quantifizierbare Daten umzuwandeln. Gemeinsam bilden sie eine vollständige technische Kette von der Probenentnahme bis zur Artenauflösung. Im Folgenden untersuchen wir systematisch die biologischen Grundlagen und den experimentellen Workflow dieser Technologie.

ITS Regionenübersicht

Der interne transkribierte Spacer (ITS)-Bereich, eingebettet in die ribosomalen RNA (rRNA)-Gencluster von Pilzen, dient aufgrund seiner einzigartigen Mischung aus evolutionärer Konservierung und Variabilität als Grundpfeiler der modernen Pilztaxonomie. Strukturell besteht er aus zwei Unterregionen – ITS1 (das die Lücke zwischen den 18S- und 5,8S-rRNA-Genen überspannt) und ITS2 (das zwischen den 5,8S- und 28S-rRNA-Genen liegt) – mit Längen, die typischerweise zwischen 100 und 1.000 Basenpaaren variieren, abhängig von der Art. Diese Dualität macht ihn zu einem idealen molekularen Marker: Die flankierenden 18S-, 5,8S- und 28S-rRNA-Gene entwickeln sich langsam und bieten stabile Ankerpunkte für das Primerdesign während der PCR-Amplifikation, während die dazwischen liegenden ITS1- und ITS2-Regionen schnell Mutationen ansammeln, die kürzliche Artbildungsereignisse widerspiegeln.

ITS Amplicon-Sequenzierungs-Workflow

• Probenentnahme und -verarbeitungDie Probenentnahme muss mit den Forschungszielen übereinstimmen, indem geeignete Matrizes wie Boden, Pflanzengewebe oder Wasser ausgewählt werden. Für Studien zu Bodenpilzen wird typischerweise Oberboden entnommen, der nach der Entfernung von Pflanzenresten durch ein 2 mm Sieb gesiebt wird, um partikuläre Störungen zu minimieren. Um wurzelassoziierte Pilze zu isolieren, trennt die „Wurzel-Schüttelmethode“ effektiv den Rhizosphärenboden von Mikroben auf der Wurzeloberfläche. Während der Verarbeitung ist eine strikte Temperaturkontrolle und Zeiteffizienz aufrechtzuerhalten, um DNA-Abbau zu verhindern.
• DNA-Extraktion und -ReinigungDie DNA-Extraktion ist entscheidend für eine erfolgreiche Analyse. Kommerzielle Pilz-DNA-Kits nutzen chemische Lyse und Silica-Membran-Reinigung, um Hemmstoffe wie Huminsäuren effizient zu entfernen und hochreine DNA zu gewinnen. Für anspruchsvolle Proben kombinieren Sie das Mahlen mit flüssigem Stickstoff mit der CTAB-Extraktion, um Zellwände physisch zu brechen und den Ertrag zu verbessern.
• PCR-AmplifikationDie ITS-Amplifikation verwendet pilzspezifische Primer, die auf die ITS1- oder ITS2-Regionen abzielen und die meisten Pilz-Taxa abdecken. Optimieren Sie die Schlüsselparameter: Die Annealing-Temperatur beeinflusst die Spezifität, die Zykluszahl bestimmt den Ertrag, und die Mg²⁺-Konzentration reguliert die Enzymaktivität.
• Sequenzierung und DatenanalyseReinige Amplicons werden im paired-end Sequencing auf Illumina MiSeq/NovaSeq Plattformen sequenziert, wodurch Millionen von Rohdaten erzeugt werden. Die Analysepipeline umfasst Qualitätsfilterung, OTU-Klusterung, Artenannotation und Diversitätsmetriken.

Prozess der ITS-Amplicon-Sequenzierung

Anwendungen der ITS-Amplikon-Sequenzierung

Die ITS-Amplicon-Sequenzierung hat sich in Bereichen von der Landwirtschaft bis zur klinischen Diagnostik als unverzichtbar erwiesen und bietet eine unvergleichliche Präzision in der Analyse von Pilzgemeinschaften. Im Folgenden zeigen drei Fallstudien ihr transformatives Potenzial.

White et al. verwendeten die ITS-Amplicon-Sequenzierung, um die Diversität des Pilz-Mikrobioms zu charakterisieren. Durch die Analyse von ITS-Daten aus menschlichen Magenflüssigkeitsproben über die CloVR-ITS-Pipeline identifizierten sie Candida quercitrusa (in allen Proben vorhanden) und Aspergillus spp. (in ausgewählten Proben nachgewiesen) und bestätigten die Fähigkeit der Methode, dominante Pilz-Taxa zu unterscheiden. Als cloud-kompatibles Werkzeug optimiert CloVR-ITS die automatisierte Analyse und macht umfassende Studien zur Pilzgemeinschaft zugänglicher.

Nutzung der ITS-Amplifikationssequenzierung zur Analyse von pilzlichen Mikrobengemeinschaften (White et al., 2022)

Sommermann und Kollegen analysierten die Pilzgemeinschaften im landwirtschaftlichen Boden mithilfe von ITS-Amplicon-Sequenzierung, um zu bewerten, wie sich Bearbeitungsmethoden, Düngemittelmengen und Fruchtfolge-Muster auf die Pilzvielfalt auswirkten. Ihre Studie ergab, dass die Sequenzierung sowohl der ITS1- als auch der ITS2-Regionen 296 Pilzgattungen und 3.398 operationale taxonomische Einheiten (OTUs) nachwies, wobei ITS1 eine höhere OTU-Reichtum zeigte. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die Bearbeitungsstrategien die Strukturen der Pilzgemeinschaften signifikant veränderten, während die Düngung einen schwächeren, statistisch insignifikanten Einfluss hatte. Zum Beispiel war die Gattung Fusarium unter intensiver Düngung in konservierenden Bearbeitungssystemen mit vorhergehenden Maisfrüchten stark angereichert, während Phoma mit konventioneller Bodenbearbeitung und vorhergehenden Rapsfrüchten assoziiert war. Darüber hinaus zeigten viele nützliche Pilze, wie arbuskuläre Mykorrhizapilze (AMF), unterschiedliche Reaktionen auf die Bearbeitungspraktiken. Diese Ergebnisse bieten eine wissenschaftliche Grundlage für die Optimierung des Managements der Bodenbiodiversität in landwirtschaftlichen Ökosystemen.

Anwendung der ITS-Amplicon-Sequenzierung in der Forschung zu Pilzgemeinschaften in landwirtschaftlichen Böden (Sommermann et al., 2021)

Datenanalysemethoden für ITS-Amplicon-Sequenzierung

Rohdaten von Hochdurchsatz-Sequenzierung erfordert Qualitätskontrolle, Artenannotation und Diversitätsanalyse, um Nukleotidsequenzen in biologisch bedeutungsvolle Gemeinschaftsmetriken zu transformieren. Im Folgenden skizzieren wir wichtige Werkzeuge und logische Rahmenbedingungen für eine effektive Dateninterpretation.

Analytische Ansätze für Daten aus ITS-Amplicon-Sequenzierung

Beliebte Software und Tools: Funktionaler Vergleich und Auswahlstrategien

QIIME2 und mothur dominieren als zwei führende Analyseplattformen. QIIME2 zeichnet sich durch seine benutzerfreundliche Oberfläche aus, die modulare Workflows (DADA2-Denoising, Phyloseq-Visualisierung) unterstützt und ideal für Anfänger ist. Im Gegensatz dazu bietet mothur flexible Befehlszeilenoperationen, die eine Anpassung von Parametern wie OTU-Clustering-Algorithmen ermöglichen und sich an fortgeschrittene Benutzer richten. Für Pilzdaten verbessert die Kombination von USEARCH (für schnelles OTU-Clustering) mit der UNITE-Datenbank (für die Artenebene Annotation) sowohl die Effizienz als auch die Genauigkeit.

Datenanalyse Workflow: Von Rohdaten zu biologischen Erkenntnissen

• QualitätskontrolleBeginnen Sie mit der Bewertung der Rohlesequalität mit FastQC, und trimmen Sie dann niedrigqualitative Basen (Q<20) und Adaptersequenzen mit Trimmomatic. In Studien zum Bodenmikrobiom erhöht dieser Schritt typischerweise den Anteil der verwendbaren Reads von 85 % auf 95 %, was zuverlässige Daten für die nachfolgende Analyse gewährleistet.
• OTU-Klusterung und ArtenannotationVerwenden Sie DADA2 oder UPARSE für die OTU-Klusterung. DADA2 erzeugt Amplicon-Sequenzvarianten (ASVs) durch Rauschunterdrückung und erreicht eine Auflösung auf Einzel-Nukleotid-Ebene, während UPARSE OTUs mit 97% Ähnlichkeit für eine breitere Kompatibilität gruppiert. Die Artenannotation basiert auf dem "Species Hypothesis"-Rahmen von UNITE, der über 90% der ITS-Sequenzen genau der taxonomischen Art zuordnet.
• VielfaltsanalyseVerwenden Sie Alpha-Diversitätsindizes (z. B. Shannon, Chao1), um die Artenvielfalt und -gleichmäßigkeit innerhalb von Proben zu messen, sowie Beta-Diversitätswerkzeuge (z. B. Bray-Curtis-Distanz, PCoA-Diagramme), um mikrobielle Gemeinschaften zwischen Proben zu vergleichen. Beispielsweise zeigte die Beta-Diversitätsanalyse in der Forschung zur Aufforstung signifikante Unterschiede in der Struktur der Pilzgemeinschaft zwischen Sekundär- und Primärwäldern (R²=0,65, p<0,01), die hauptsächlich durch den pH-Wert des Bodens und den Gehalt an organischer Substanz bedingt waren.

Ergebnisinterpretation: Daten in einen biologischen Kontext übersetzen

Interpretieren Sie Diversitätsmetriken zusammen mit Umweltfaktoren. Hohe Shannon-Werte deuten oft auf ökologisch stabile Systeme hin, wie gesunde Böden mit ausgewogenen mikrobiellen Gemeinschaften, während niedrige Chao1-Werte auf einen Artenverlust in verschmutzten Umgebungen hindeuten können. Validieren Sie die OTU-Anmerkungen funktional – zum Beispiel, korrelieren Sie erhöhte Abundanzen von pathogenen Pilzen wie Fusarium mit Aufzeichnungen über Pflanzenkrankheiten oder verknüpfen Sie die erhöhte Präsenz von nützlichen arbuskulären Mykorrhizapilzen (AMF) mit einer verbesserten Nährstoffaufnahme von Pflanzen.

Fazit

Mit dem Aufstieg von Sequenzierungstechnologien der dritten Generation wie PacBio wechselt die ITS-Amplicon-Sequenzierung von Kurzlese- (Illumina) zu Langlese- (PacBio HiFi) Ansätzen, wodurch Variationen in der ITS-Sequenzlängenauflösung und die Genauigkeit der Assemblierung verbessert werden. KI-gesteuerte Werkzeuge, wie z. B. Deep-Learning-Modelle, optimieren die Langlese-Ausrichtung und die Entfernung von Chimären und senken technische Barrieren. Zukünftige Fortschritte werden die ITS-Sequenzierung mit Metagenomik und Metabolomik integrieren und ein "Multi-Omics"-Rahmenwerk für die Pilzforschung schaffen. Dieser ganzheitliche Ansatz wird tiefere Einblicke in ökologische Erhaltung, nachhaltige Landwirtschaft und menschliche Gesundheit bieten und globale Herausforderungen wie den Klimawandel, die Ernährungssicherheit und die Kontrolle von Infektionskrankheiten angehen.

Die ITS-Amplicon-Sequenzierung hat sich aufgrund ihrer hohen Durchsatzrate und Präzision zum Goldstandard für Studien zu Pilzgemeinschaften entwickelt. Von der Umweltüberwachung über medizinische Diagnosen bis hin zu landwirtschaftlichen Anwendungen und industriellen Prozessen treibt diese Technologie die Pilzforschung in die molekulare Ära und bietet entscheidende Lösungen für weltweite Probleme.

Referenzen:

1. White JR, Maddox C, et al. "CloVR-ITS: Automatisierte Analysepipeline für die Sequenzierung von internen transkribierten Spacer-Ampliconen zur Charakterisierung von Pilz-Mikrobiota." Mikrobiom2013; 1(1):6. Es tut mir leid, ich kann den Inhalt von URLs nicht abrufen oder übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.
2. Sommermann L, Geistlinger J, et al. "Pilzgemeinschaftsprofile in landwirtschaftlichen Böden eines Langzeitfeldversuchs unter verschiedenen Bedingungen von Bodenbearbeitung, Düngung und Fruchtfolge, analysiert durch Hochdurchsatz-ITS-Amplikon-Sequenzierung." PLoS One2018; 13(4):e0195345. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Bitte geben Sie den Text ein, den Sie übersetzen möchten.