Ein Anfängerleitfaden zur 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

Was ist 16S/18S/ITS-Amplikon-Sequenzierung?

Amplicon-Sequenzierung ist ein gezielter Ansatz, der sich auf spezifische Regionen der DNA oder RNA innerhalb einer Probe konzentriert. Er umfasst die Amplifikation und Sequenzierung eines bestimmten Gens oder genomischen Bereichs von Interesse. Die am häufigsten anvisierte Region in der mikrobiellen Ökologie ist das 16S rRNA-Gen für Bakterien und Archaeen. Dieses Gen enthält konservierte Regionen, die das Design universeller Primer ermöglichen, die eine breite Palette von mikrobiellen Taxa amplifizieren und sequenzieren können. Durch die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens können Forscher die taxonomische Zusammensetzung der in der Probe vorhandenen mikrobiellen Gemeinschaft bestimmen. Die Amplicon-Sequenzierung liefert Informationen über die Vielfalt und relative Häufigkeit verschiedener Taxa, ist jedoch in ihrer Fähigkeit, funktionale Informationen bereitzustellen, eingeschränkt.

Wenn Sie mehr darüber erfahren möchten, lesen Sie bitte unseren Artikel. Prinzipien und Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS-Amplikon-Sequenzierung.

Was ist der Unterschied zwischen Metagenomik und Amplicon-Sequenzierung?

Metagenomische SequenzierungAndererseits umfasst es die Sequenzierung des gesamten genetischen Materials (DNA oder RNA), das in einer Probe vorhanden ist, ohne spezifische Regionen anzusprechen. Es bietet einen umfassenden Überblick über die gesamte mikrobielle Gemeinschaft, einschließlich sowohl bekannter als auch unbekannter Mikroorganismen. Die metagenomische Sequenzierung kann nicht nur die taxonomische Zusammensetzung der Gemeinschaft identifizieren, sondern auch das funktionale Potenzial der vorhandenen Mikroorganismen. Durch die Analyse des gesamten genetischen Materials können Forscher das gesamte mikrobielle Genom untersuchen und das Vorhandensein spezifischer Gene und Wege identifizieren, die an verschiedenen Funktionen wie Stoffwechsel, Antibiotikaresistenz und Virulenz beteiligt sind. Die metagenomische Sequenzierung bietet eine höhere Auflösung in Bezug auf die taxonomische Identifizierung und das funktionale Potenzial im Vergleich zur Amplicon-Sequenzierung, kann jedoch rechnerisch und finanziell anspruchsvoller sein.

Beziehen Sie sich auf Einführung in die Shotgun-Metagenomik, von der Probenahme bis zur Datenanalyse für weitere Informationen.

Zusammenfassend bietet die Amplicon-Sequenzierung Informationen über die taxonomische Zusammensetzung und relative Häufigkeit spezifischer mikrobieller Taxa innerhalb einer Gemeinschaft, während die metagenomische Sequenzierung einen umfassenderen Überblick über die gesamte mikrobielle Gemeinschaft bietet, einschließlich taxonomischer Informationen sowie funktionalem Potenzial. Die Wahl zwischen Amplicon-Sequenzierung und metagenomischer Sequenzierung hängt von den Forschungszielen, den verfügbaren Ressourcen und dem erforderlichen Detaillierungsgrad für die Analyse ab.

Sanger-Sequenzierung vs. NGS-basierte gezielte Sequenzierung vs. Langzeit-Sequenzierung

Die Amplicon-Sequenzierung, die sowohl die Sanger-Sequenzierung als auch Ansätze der Next-Generation-Sequenzierung (NGS) umfasst, hat sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften und gezielter genetischer Analysen etabliert. Das Verständnis der Stärken und Einschränkungen jeder Technik ist entscheidend für die Entwicklung effektiver experimenteller Strategien und die genaue Interpretation der Ergebnisse.

Durch die Anwendung von Kettenabbruchprinzipien, Sanger-Sequenzierung liefert zuverlässige und hochgenaue Sequenzierungsdaten, was es zu einer idealen Wahl für die Bestätigung und Validierung von Ergebnissen aus größeren Amplicon-Sequenzierungsprojekten macht. Aufgrund seiner geringen Durchsatzrate und der zeitaufwändigen Natur ist die Sanger-Sequenzierung jedoch weniger geeignet für Hochdurchsatzstudien, die eine große Anzahl von DNA-Fragmenten umfassen.

Die Kraft von nutzen Next-Generation-Sequenzierung Plattformen wie die Illumina-Sequenzierung und Strategien wie die Amplicon-Sequenzierung oder Hybrid-Capture zur selektiven Anreicherung der interessierenden Regionen. Die Fähigkeit, Proben zu multiplexen, bei der mehrere Proben zusammengeführt und gemeinsam sequenziert werden, erhöht die Durchsatzrate erheblich und senkt die Kosten pro Probe, was eine umfassende Analyse komplexer genetischer Variationen und vielfältiger mikrobielle Gemeinschaften erleichtert.

Darüber hinaus ist es wichtig, das Auftreten von Langzeit-Sequenzierung Technologien wie PacBio-Sequenzierung und Oxford Nanopore-SequenzierungIm Kontext der Amplicon-Sequenzierung bietet das Langzeit-Sequenzieren unvergleichliche Vorteile, insbesondere deutlich längere Sequenzierungsreads in Anwendungen wie der de novo Genomassemblierung, Haplotyp-Phasierung und Charakterisierung komplexer genomischer Umstellungen. Es ist jedoch erwähnenswert, dass Langzeit-Sequenzierungstechnologien im Allgemeinen höhere Fehlerraten aufweisen und Einschränkungen hinsichtlich Durchsatz und Kosten pro Base haben.

Jede Methode hat ihre eigenen spezifischen Stärken und Überlegungen, die eine sorgfältige Berücksichtigung der Forschungsziele, der Stichprobengröße, der gewünschten Abdeckung und der verfügbaren Ressourcen erfordern.

Bakterielle 16S rRNA

Es gibt drei Arten von bakterieller ribosomaler RNA (rRNA): 5S rRNA (120 bp), 16S rRNA (etwa 1540 bp) und 23S rRNA (etwa 2900 bp). 16S rRNA kommt häufig in prokaryotischen Zellen vor und hat einen hohen Gehalt sowie eine hohe Kopienzahl (mehr als 80 % der gesamten bakteriellen RNA), einfachen Zugang zu Vorlagen, hohe funktionale Homologie und moderate genetische Informationen. Die 16S rRNAs sind häufig in prokaryotischen Zellen zu finden und haben einen hohen Gehalt sowie eine hohe Kopienzahl (80 % der gesamten bakteriellen RNA).

Es gibt neun konservierte Regionen und neun hochvariable Regionen in der Sequenz des 16S rRNA kodierenden Gens. Unter ihnen hat die V3-V4-Region eine gute Spezifität und vollständige Datenbankinformationen, was sie zur besten Wahl für die Annotation der bakteriellen Diversitätsanalyse macht.

Das Schema des Ribosomenkomplexes und des 16S rRNA-Gens. (Fukuda et al., 2016)

Eukaryotische 18S rRNA

Das 18S rRNA-Gen ist eine DNA-Sequenz, die eine kleine Untereinheit der eukaryotischen Ribosomen kodiert und sowohl konservierte als auch variable Regionen (V1-V9, ohne V6-Region) aufweist. Unter ihnen ist die V4-Region die am häufigsten verwendete, hat die vollständigsten Datenbankinformationen und die beste Klassifikation und ist die beste Wahl für die Annotation der Analyse des 18S rRNA-Gens.

18S rRNA-Gen.

Archaeales 16S rRNA

Archaebakterien, auch bekannt als Archaebakterien und Archaea, sind eine ganz besondere Klasse von Bakterien, die einige Eigenschaften sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten aufweisen. Für die Illumina 2×250 bp Sequenzierungsplattform ist der Primer 519F/915R am besten geeignet.

Pilz-ITS-Sequenzen

ITS-Sequenzen sind Internally Transcribed Spacer (ITS 1 und ITS 2), die zwischen den rRNA-Genen 18S, 5,8S und 28S von Pilzen liegen. ITS-Sequenzfragmente sind klein (350 bp und 400 bp für ITS 1 und ITS 2, respectively), leicht zu analysieren und wurden weit verbreitet für die phylogenetische Analyse verschiedener Pilzarten verwendet.

Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) Studien von Pilzgemeinschaften. (Nilsson et al., 2019)

Diversityanalyse spezifischer funktioneller Mikroorganismen

Funktionale Mikroorganismen sind eine Klasse von Mikroorganismen, die in der Natur aufgrund ihrer funktionalen Bedeutung, wie nitrifizierende Bakterien, denitrifizierende Bakterien, ammoniakoxidierende Bakterien, sulfatreduzierende Bakterien, stickstofffixierende Bakterien usw., große Aufmerksamkeit erhalten haben.

Jedes funktionale Mikroorganismus kann taxonomisch sehr unterschiedlich sein, hat jedoch ähnliche Gene, die es ihnen ermöglichen, die gleiche Funktion auszuführen. Daher werden die Gene, die diesen funktionalen Bakterien ermöglichen, diese spezifische Funktion auszuführen, als funktionale Gene bezeichnet, wie z.B. nxrA, nirS/nirK, amoA, dsrB, nifH, nifH.

Workflow der Analyse von Amplicon-Sequenzierungsdaten

Die nachgelagerten Daten werden gefiltert, um niedrigqualitative Reads zu entfernen, und die verbleibenden hochqualitativen Clean-Daten können für die Nachanalyse verwendet werden; die Reads werden durch die Überlappungsbeziehung zwischen den Reads zu Tags zusammengefügt; die Tags werden mit einer bestimmten Ähnlichkeit in OTUs gruppiert, und dann werden die OTUs mit der Datenbank verglichen, um die OTUs mit Arten zu annotieren; basierend auf den OTUs und den Ergebnissen der Artenannotation wurden Analysen zur Komplexität der Artenvielfalt der Proben und zu den Artenunterschieden zwischen den Gruppen durchgeführt.

CD Genomics Amplicon-Sequenzierungsanalyse-Pipeline

Bitte lesen Sie unseren Artikel. Bioinformatikanalyse von 16S rRNA-Amplikon-Sequenzierung für weitere Einzelheiten.

Anwendung der Amplicon-Sequenzierungstechnologie

Die Amplicon-Sequenzierung findet umfangreiche Anwendungen in verschiedenen Bereichen und ermöglicht es Forschern, mikrobielle Gemeinschaften in unterschiedlichen Umgebungen zu erkunden und zu verstehen. Zu den bemerkenswerten Anwendungsbereichen gehören:

(i) Medizinisches FachgebietDie Amplicon-Sequenzierung ermöglicht es, die Beziehung zwischen Mikroorganismen und menschlichen Krankheiten zu untersuchen. Sie hilft dabei, die Rolle von mikrobielle Gemeinschaften bei Erkrankungen wie Stoffwechselerkrankungen, Verdauungserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Tumorkrebs, neurologischen Erkrankungen und anderen Beschwerden zu erforschen. Durch die Profilierung der Mikrobiota können Forscher potenzielle Biomarker, therapeutische Ziele und Interventionen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit identifizieren.

(ii) TierhaltungDie Amplicon-Sequenzierung spielt eine entscheidende Rolle beim Studium der Interaktionen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften im Darm, Pansen und anderen tierassoziierten Umgebungen. Sie hilft Forschern, die Auswirkungen der Mikrobiota auf die Fortpflanzung, das Wachstum und die Entwicklung von Tieren, die ernährungsphysiologische Gesundheit, die Immunfunktion und die Krankheitsbehandlung zu untersuchen. Durch das Verständnis der mikrobiellen Ökologie in Tiersystemen können Wissenschaftler die Gesundheit und Produktivität von Tieren optimieren.

(iii) LandwirtschaftDie Amplicon-Sequenzierung erleichtert die Untersuchung mikrobieller Interaktionen im Rhizosphäre und anderen pflanzenassoziierten Umgebungen. Forscher können die Auswirkungen landwirtschaftlicher Praktiken wie Bodenbearbeitung, Düngung und Fruchtfolge auf die mikrobielle Gemeinschaft im Boden untersuchen. Das Verständnis des Zusammenspiels zwischen Mikroorganismen und Pflanzen trägt zur Verbesserung der landwirtschaftlichen Produktivität, des Nährstoffkreislaufs, der Pflanzen Gesundheit und nachhaltiger Anbaumethoden bei.

(iv) UmweltstudienDie Amplicon-Sequenzierung ermöglicht die Charakterisierung mikrobieller Gemeinschaften in verschiedenen Umgebungen, einschließlich verschmutzter Bereiche wie Smog, Staub, Wohngebiete, Einkaufszentren und natürlichen Lebensräumen wie Gewässern und marinen Ökosystemen. Sie trägt zum Verständnis der Verteilung, Zusammensetzung und Dynamik mikrobieller Populationen in verschiedenen Ökosystemen bei. Darüber hinaus leistet die Amplicon-Sequenzierung einen Beitrag zur Forschung über die Fermentation und Behandlung organischer Düngemittel, die Abwasserbehandlung, den Ölabbau und andere Umweltprozesse.

(v) BioenergieDie Amplicon-Sequenzierung spielt eine entscheidende Rolle in der Bioenergie-Forschung, indem sie die Identifizierung und Charakterisierung spezieller funktioneller Stämme und Gene ermöglicht, die für die Biokraftstoffproduktion relevant sind. Sie unterstützt das Gene Mining und die Entwicklung von gentechnisch veränderten Bakterien mit verbesserten Fähigkeiten zur Bioenergieproduktion.

(vi) Spezielle extreme UmgebungenAmplicon-Sequenzierung ist entscheidend für das Studium von mikrobiellen Taxa, die in extremen Umweltbedingungen gedeihen, wie extremen Temperaturen, hoher Salinität, saurem oder alkalischem pH-Wert und anderen herausfordernden Umgebungen. Durch die Analyse der mikrobiellen Vielfalt und des funktionalen Potenzials in diesen extremen Umgebungen gewinnen Forscher Einblicke in die Anpassungsstrategien von Mikroorganismen und deren Rolle in der Dynamik von Ökosystemen.

Arten von Proben für die Amplicon-Sequenzierung

Amplicon-Sequenzierungstechniken, einschließlich 16S-, 18S- und ITS-Amplicon-Sequenzierung, sind auf eine Vielzahl von Probenarten anwendbar.

Bitte überprüfen Sie unser Richtlinien zur Einreichung von Mustern für die umfassendsten Methoden zur Probenentnahme und -handhabung bei Amplicon-Sequenzierungen.

Referenzen:

1. Fukuda, Kazumasa, et al. "Molekulare Ansätze zur Untersuchung mikrobieller Gemeinschaften: Zielgerichtete Analyse des 16S ribosomalen RNA-Gens." Journal der UOEH 38.3 (2016): 223-232.
2. Nilsson, R. Henrik, et al. "Mycobiom-Diversität: Hochdurchsatz-Sequenzierung und Identifizierung von Pilzen." Nature Reviews Microbiology 17.2 (2019): 95-109.