Prinzipien und Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

16S/18S/ITS Amplifikationssequenzierung verwendet die Plattform der nächsten/dritten Generation Sequenzierung und führt Hochdurchsatzsequenzierung von PCR-Produkten aus spezifischen Regionen wie 16S rDNA/18S rDNA/ITS/funktionalen Genen durch. Es überwindet den Nachteil einiger Mikroorganismen, die schwer oder unmöglich zu kultivieren sind, und erhält Informationen über die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur, evolutionäre Beziehungen und die mikrobielle Korrelation mit der Umwelt in Umweltproben.

Was ist 16S rDNA / 18S rDNA / ITS?

16S rDNA: 16S rDNA ist eine DNA-Sequenz, die die kleine Untereinheit der rRNA von Prokaryoten kodiert und eine Länge von etwa 1542 bp hat. Mit einer moderaten Molekülgröße und einer niedrigen Mutationsrate ist 16S rDNA der am häufigsten verwendete Marker in der Untersuchung der bakteriellen Systematik. Die 16S rDNA-Sequenz besteht aus 9 variablen Regionen und 10 konservativen Regionen. Die Sequenzen der konservierten Regionen spiegeln die genetischen Beziehungen zwischen den Arten wider, während die Sequenzen der variablen Regionen die Unterschiede zwischen den Arten darstellen. Die 16S rDNA-Sequenzierung wird hauptsächlich verwendet, um die Vielfalt von Bakterien oder Archaeen zu analysieren.

Abb. 1 16S rDNA und Amplifikationsprimer

18S rDNA: 18S rDNA ist eine DNA-Sequenz, die die kleine Untereinheit der rRNA von eukaryotischen Ribosomen kodiert. Wie 16S rDNA besteht die 18S rDNA-Sequenz ebenfalls aus konservativen Regionen und variablen Regionen (V1-V9, ohne V6). Unter den variablen Regionen hat V4 die vollständigsten Datenbankinformationen und die beste Klassifikationseffektivität, es ist die am häufigsten verwendete und die beste Wahl für die Analyse von 18S rRNA-Genen. Die Sequenzierung von 18S rDNA spiegelt die Artenunterschiede zwischen eukaryotischen Organismen in gegebenen Proben wider.

Abb. 2 18S rDNA und Amplifikationsprimer

ITS: ITS (Interne Transkripte Spacer) ist Teil des nicht-transkriptionalen Bereichs des rRNA-Gens von Pilzen. Die für die Identifizierung von Pilzen verwendeten ITS-Sequenzen umfassen normalerweise ITS1 und ITS2. Da die rRNA-Gene 5.8S, 18S und 28S bei Pilzen stark konserviert sind, während ITS im evolutionären Prozess aufgrund geringeren natürlichen Selektionsdrucks mehr Mutationen tolerieren kann und in den meisten Eukaryoten eine extrem breite Sequenzpolymorphie aufweist. Gleichzeitig ist der konservative Typ von ITS innerhalb der Arten relativ konsistent, und die Unterschiede zwischen den Arten (oder sogar Stämmen) sind offensichtlich. ITS-Sequenzfragmente sind klein (350 bp und 400 bp lang) und leicht zu analysieren. Sie wurden weitreichend in der phylogenetischen Analyse verschiedener Pilze verwendet.

Abb. 3 ITS- und Amplifikationsprimer

Was ist die Amplicon-Sequenzierung von 16S/18S/ITS?

Das methodologische Prinzip der amplifizierten Fragmentsequenzierung nutzt die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Technologie, um gezielt bestimmte Ziel-DNA-Fragmente zu amplifizieren. Im Allgemeinen bezieht sich dies auf die 16S rRNA-Genregionen von Bakterien und Archaeen oder die 18S rRNA/ITS-Regionen für Eukaryoten. Diese Fragmente verkörpern hochkonservierte Sequenzregionen und umfassen gleichzeitig ausreichende Variationszonen, wodurch sie kompetente Instrumente zur Erkennung und Differenzierung verschiedener Mikroben darstellen.

16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung verwendet Illumina oder PacBio-Sequenzierung die PCR-Produkte zu lesen, die mit geeigneten universellen Primern einer oder mehrerer Regionen amplifiziert wurden 16S/18S/ITSDurch die Erkennung der Sequenzvariationen und der Häufigkeit des Zielbereichs können Informationen über die Artenklassifikation und -häufigkeit, die Populationsstruktur, die phylogenetische Evolution und den Vergleich von Gemeinschaften in Umweltproben gewonnen werden. Die Untersuchung der mikrobiellen Vielfalt hat bedeutende theoretische und praktische Implikationen für das Verständnis der Beziehungen zwischen Mikroben und der Umwelt, das Umweltmanagement sowie die Nutzung mikrobieller Ressourcen.

Vorteile der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

Effizienz bei der Identifizierung: Im Vergleich zu traditionellen Identifikationsmethoden wie Klonen oder Kultivieren, ermöglicht das Sequenzieren mikrobieller Gemeinschaften von 16S/18S/ITS bietet einen schnelleren und genaueren Ansatz.

Geschwindigkeit: Im Gegensatz zu traditionellen Methoden der mikrobiellen Klassifikation und Identifikation erzeugt die Amplicon-Sequenzierung in relativ kurzer Zeit erhebliche Datenmengen, wodurch die Verarbeitung und Analyse mikrobieller Proben beschleunigt wird.

Hohe Empfindlichkeit: Die Amplicon-Sequenzierung kann Arten mit geringer Häufigkeit innerhalb mikrobieller Gemeinschaften nachweisen, selbst solche, die nur einen minimalen Anteil innerhalb der Gemeinschaft ausmachen, können effektiv identifiziert werden.

Vielfalt: Die Amplicon-Sequenzierung ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer mikrobieller Gemeinschaften und umfasst eine Vielzahl von Mikroben wie Bakterien, Archaeen und Pilze, was ihre weitreichende Anwendbarkeit fördert.

Doppelte Regionsdetektion: Dieser Ansatz bietet Flexibilität beim Anvisieren von einem oder mehreren variablen Regionen, was längere Sequenzlesungen und eine genauere Analyse von Kolonien ermöglicht.

Niedrigere Kosten: Amplicon-Sequenzierung erfordert weniger Tiefe im Vergleich zu metagenomische Sequenzierungund bietet somit eine bessere Kosten-Effektivität.

Quantifizierbar: Die Amplicon-Sequenzierung ermöglicht eine quantitative Analyse von Sequenzierungsdaten, indem sie die relative oder absolute Häufigkeit von Mikroben bestimmt und somit eine quantitative Bewertung der Zusammensetzung und Veränderungen von Mikrobengemeinschaften ermöglicht.

Workflow der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

Die wichtigsten Schritte von 16S/18S/ITS-Amplikon-Sequenzierung einschließlich der Extraktion von Gesamt-DNA aus Proben, PCR-Amplifikation von Zielbereichen, Bibliothekskonstruktion, Sequenzierung und bioinformatischer Analyse.

Abb. 4 Der Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

DNA-Extraktion: Dies kennzeichnet den Prozess der Gewinnung von gesamter DNA aus einer gegebenen Probe. Die extrahierte DNA umfasst Segmente, die von verschiedenen Mikroorganismen stammen, einschließlich Bereiche des angestrebten Gens.

Gezielte Region PCR-Amplifikation: Die primären Elemente bestehen aus der Primer-Design, der PCR-Amplifikation, der Reinigung der Produkte und der abschließenden Bewertung der Reinheit dieser Produkte. Das Design des Primers sollte eng und spezifisch mit der Sequenz im interessierenden Bereich integriert sein, oft in einem konservativen Bereich entworfen, um die Spezifität der Amplifikation zu gewährleisten. Die PCR-Amplifikation umfasst die Vorbereitung der entsprechenden Mischung, die Optimierung der PCR-Reaktionsbedingungen und anschließend die Durchführung der PCR-Amplifikationsreaktion.

Das wesentliche PCR-Protokoll umfasst eine Reihe von Zyklen, einschließlich Denaturierung, Annealing und Elongationsphasen, die es dem Primer ermöglichen, sich an die DNA-Vorlage zu binden und neue DNA-Stränge zu erzeugen. Die Nebenprodukte der PCR-Reaktion erfordern eine Reinigung mit einem PCR-Reinigungskit, um nicht reagierte Primer, dNTPs und andere Verunreinigungen zu entfernen. Schließlich wird die Gelelektrophorese eingesetzt, um die Größe und Reinheit der amplifizierten Produkte zu überprüfen, wodurch das Vorhandensein nur der Amplifikationsprodukte der Zielregion bestätigt wird.

Bibliotheksbau: Wir empfehlen die Methode zur Konstruktion von Fusions-Primern, das heißt, die Primer werden mit den Zielsequenz-Primern sowie den Adaptern, Indizes und anderen Sequenzen im Voraus synthetisiert, und anschließend werden die genomischen DNA-Ziele direkt durch PCR amplifiziert. Die Amplicon-Bibliotheken werden gereinigt und ein äquimolarer Pool der Amplicon-Bibliotheken wird vorbereitet. Die erforderliche Verdünnung für die Template-Vorbereitung wird bestimmt und anschließend erfolgt die Sequenzierung.

Sequenzierung: Die aktuellen Sequenzierungsplattformen umfassen hauptsächlich Illumina Miseq/HiSeq und Plattformen der dritten Generation.

• Illumina NGS (MiSeq/HiSeq2500/HiSeq4000): Aufgrund der Begrenzung der Lese-Länge kann die NGS-Plattform nur eine einzelne variable Region, doppelte variable Regionen oder dreifache variable Regionen als Zielregionen für die Sequenzierung auswählen. Bei der Sequenzierung können nur die vollständig sequenzierten Reads (Tags) für weitere Analysen verwendet werden, daher sollten verschiedene Amplifikationsregionen strikt der entsprechenden Sequenzierungsstrategie folgen. Wenn Sie beispielsweise V4 für die Analyse gewählt haben, ist die PE250-Sequenzierung erforderlich, während für die V1-V3-Regionen die Sequenzierungsstrategie PE300 sein sollte. Nur so kann die Vollständigkeit der Sequenzen sichergestellt werden. Die Originaldaten werden gefiltert, um niedrigqualitative Reads zu entfernen und hochwertige saubere Daten für die spätere Analyse zu hinterlassen.
• PacBio SMRT-SequenzierungIm Gegensatz zu NGS kann die Plattform der dritten Generation eine Vollsequenzierung für 16S/18S/ITS durchführen, und ihre Sequenzanpassungsrate sowie die Identifikationsgenauigkeit sind höher als die von NGS.

Bioinformatikanalyse: Reads werden gemäß der Überlappungsbeziehung zwischen den Reads in Tags gesplittet, und Tags werden mit einer bestimmten Ähnlichkeit zu OTUs aggregiert, die dann durch den Vergleich von OTUs mit Datenbanken annotiert werden.

Betriebliche taxonomische Einheiten (OTUs) werden häufig verwendet, um Gruppen eng verwandter Individuen zu klassifizieren. Im Allgemeinen können Sequenzen, deren Ähnlichkeit höher als 97 % ist, als OTU definiert werden. Jede OTU entspricht einer anderen 16S rDNA/18S rDNA/ITS-SequenzDas heißt, jede OTU entspricht einer Art. Durch die OTU-Analyse kann die mikrobielle Vielfalt und die Häufigkeit verschiedener Mikroorganismen in der Probe ermittelt werden.

Basierend auf den Ergebnissen der OTU- und Artenannotation werden dann Analysen zur Artenkomplexität der Proben und zur Artenunterschiedsanalyse durchgeführt. Auch eine artenbasierte Analyse, eine LDA-Effektgrößenanalyse und weitere Analysen werden bereitgestellt.

Abb. 5 Der zentrale Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

Anwendung der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung

Die Nutzung von 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung spannen mehrere Sektoren ein, darunter Biologie, Medizin und mehr. Diese Sequenzen, einschließlich 16S rRNA, 18S rRNA und ITS, fungieren als molekulare Fingerabdrücke von Organismen wie Bakterien, Archaeen und Pilzen und spiegeln somit die Zusammensetzung und Struktur mikrobieller Gemeinschaften wider. Der Prozess der Amplicon-Sequenzierung dieser Sequenzen ermöglicht es, die Vielfalt, Häufigkeit und Verteilungseigenschaften von Mikrobiota in unterschiedlichen Umweltproben wie Boden, aquatischen Lebensräumen, Darmflora usw. zu verstehen. Dies offenbart folglich die Struktur und evolutionären Tendenzen mikrobieller Gemeinschaften. Darüber hinaus, 16S/18S/ITS-Amplikon-Sequenzierung bietet ein wichtiges Werkzeug für die Klassifizierung und Identifizierung von MikrobenDurch den Vergleich von Amplicon-Sequenzen mit bekannten Sequenzen in Datenbanken können unbekannte Mikroben kategorisiert und ihr taxonomischer Status sowie ihre phylogenetischen Beziehungen bestimmt werden. Dies ist von erheblicher Bedeutung für die Identifizierung neuer Arten, die Typisierung von Umweltmikroben und die Erkennung pathogener Mikroben.

Abbildung 6. Netzwerk-Analyse der mikro-eukaryotischen Gemeinschaft auf Phylum-Ebene. (Xu et al., 2020)

Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle in der Biosphäre, indem sie am Stoffkreislauf und dem Fluss von Energie teilnehmen, die Bodenfruchtbarkeit erhöhen, die Pflanzen Gesundheit fördern und im Darm von Tieren wirken. Durch den Einsatz von 16S/18S/ITS Amplicon-SequenzierungWir können die funktionalen Merkmale mikrobieller Gemeinschaften untersuchen, wie zum Beispiel die, die am Stickstoff- und Kohlenstoffkreislauf sowie an der Biolumineszenz-Synthese beteiligt sind, und damit unser Verständnis der Auswirkungen und Rollen von Mikrobiomen innerhalb von Ökosystemen vertiefen.

In der Krankheitsdiagnose und -behandlung ist die mikrobielle Gemeinschaft eng mit der Gesundheit des Wirts verbunden. 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung kann daher als Werkzeug für die Krankheitsdiagnose und -therapie dienen. Zum Beispiel ist ein Ungleichgewicht der Darmmikrobiota mit Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen und Autoimmunerkrankungen verbunden. Die Amplicon-Sequenzierung der Darmmikrobiota kann das Verständnis dieser mikrobiellen Veränderungen erleichtern und kritische Bezugspunkte für die Krankheitsdiagnose und Behandlungsstrategien bieten. In der Biotechnologie und Bioengineering werden Mikroorganismen umfassend in Prozessen wie der fermentativen Produktion, der Umweltremediation und der Biodegradation eingesetzt. Durch die Amplicon-Sequenzierung von Mikrobiomen können wir Stämme mit bestimmten Funktionen isolieren, was den Weg für die Entwicklung effizienter biologischer Technologien und ingenieurtechnischer Anwendungen ebnet.

Unterschiede zwischen 16S-Sequenzierung und metagenomischer Sequenzierung:

Sequenzierungsprinzipien:

• 16S-Sequenzierung umfasst die Amplifikation spezifischer variabler Regionen (z. B. V3-V4 oder V4) von mikrobieller genomischer DNA durch PCR nach der Extraktion, gefolgt von der Bibliothekskonstruktion und Sequenzierung.
• Metagenomische Sequenzierung zerlegt mikrobielles genomisches DNA zufällig in kleine Fragmente von 300-500 bp, fügt Sequenzierungsadapter an beiden Enden der Fragmente hinzu und fährt dann mit der Sequenzierung fort.

Variierte taxonomische Identifikationstiefe:

• Sequenzen, die aus der 16S-Sequenzierung gewonnen werden, können oft nicht bis zur Art-Ebene annotiert werden, während die metagenomische Sequenzierung Mikroorganismen bis zur Art- oder sogar Stamm-Ebene identifizieren kann.

Forschungsziele:

• Die 16S-Sequenzierung untersucht hauptsächlich die Artenzusammensetzung, die evolutionären Beziehungen zwischen Arten und die Vielfalt mikrobieller Gemeinschaften.
• Metagenomische Sequenzierung, die auf der 16S-Sequenzierungsanalyse aufbaut, ermöglicht eine eingehende Untersuchung genetischer und funktioneller Aspekte (z. B. Genontologie, Pfadanalyse).

Bei CD Genomics kann unser Expertenteam mit umfangreicher Erfahrung Ihnen helfen, mikrobielle Gemeinschaften vollständig zu verstehen und von ihnen zu profitieren. Neben der 16S/18S/ITS Amplicon-SequenzierungWir bieten auch andere Dienstleistungen im Bereich der mikrobiellen Genomik an, darunter:

Metagenomisches Shotgun-Sequencing
Virale Metagenomische Sequenzierung
Metatranskriptomische Sequenzierung
Mikrobielle Gesamte Genomsequenzierung
Viralgenom-Sequenzierung

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