Vollständige 16S rRNA-Sequenzierung verbessert die mikrobiologische Analyse auf Speziesebene

Mit dem Fortschritt der mikrobiologischen Forschung wird die Bedeutung der Identifizierung auf Artenebene in mikrobiellen Gemeinschaften zunehmend deutlich. Die genaue Identifizierung wichtiger Mikroorganismen auf Artenebene ist entscheidend für die anschließende experimentelle Validierung und mechanistische Entdeckung. Traditionelle Sequenzierungstechnologien der zweiten Generation (SGS), eingeschränkt durch kurze Leselängen, erfassen typischerweise nur 1-2 variable Regionen des 16S rRNA-Gen (z. B. die V3-V4-Region). Diese Einschränkung beeinträchtigt die Fähigkeit, Arten innerhalb mikrobieller Gemeinschaften vollständig und genau zu identifizieren, wodurch Analysen auf Artenebene unvollständig bleiben. Im Gegensatz dazu, Vollständige 16S rRNA-Sequenzierungstechnologie erfasst alle neun variablen Regionen (V1-V9) in einem einzigen Lesevorgang, was die Präzision der Artenebene-Annotation erheblich verbessert. Folglich bietet diese Technologie erhebliche Vorteile für die Forschung zu mikrobiellen Gemeinschaften, insbesondere in Bereichen wie dem Mikrobiom des Darms, der Atemwege, der Fortpflanzung, der Umwelt, der Nutztierhaltung und der Aquakultur, wo sie weit verbreitet angewendet wurde.

Demonstration der vollständigen 16S rRNA Diversitätssequenzierung

Die Abbildung unten vergleicht die Rekonstruktion einer simulierten mikrobiellen Gemeinschaft unter Verwendung von sowohl SGS als auch vollständige DiversitätssequenzierungAuf der Artenebene zeigen die SGS-Ergebnisse mehrere unannotierte Taxa und einen Mangel an Kohärenz, während die Ergebnisse der Voll-Längen-Sequenzierung alle in der Mock-Gemeinschaft vorhandenen Arten genau rekonstruieren, mit konsistenten und präzisen Annotationen.

Abbildung 1. Rekonstruktion der Mock-Gemeinschaft unter Verwendung der Diversität der zweiten Generation und der Volllängen-Diversität.

Die folgende Tabelle zeigt die Artenannotationsraten für gängige Proben unter Verwendung von Vollständige 16S rRNA-SequenzierungBemerkenswert ist, dass die Annotierungsraten auf Art-Ebene für vollständige Sequenzen äußerst zufriedenstellend sind. Bei Fäkal- und Darminhaltsproben erreicht die Annotierungsrate auf Art-Ebene 90 %, während sie bei komplexeren Umweltproben wie Boden und Wasser immer noch 75 % beträgt. Dies zeigt, dass die überwiegende Mehrheit der operationalen taxonomischen Einheiten (OTUs) oder Sequenzen genau bestimmten Arten zugeordnet werden kann, was einen erheblichen Wert bei der schnellen Identifizierung wichtiger Mikroorganismen in Proben bietet.

Die Annotierungsraten auf Arten- und Gattungsebene, basierend auf sowohl OTU- als auch Read-Daten, zeigen eindeutig die überlegene Leistung der Voll-Längen 16S rRNA Diversitätssequenzierung in der Forschung zu mikrobiellen Gemeinschaften. Dieser Vorteil ist besonders evident in klinischen, landwirtschaftlichen und umweltbezogenen Studien, wo umfassende und genaue mikrobielle Profilierung entscheidend ist.

Vorteile der Voll-Längen 16S rRNA-Sequenzierung

Die praktischen Ergebnisse, die oben skizziert wurden, unterstreichen den erheblichen Vorteil der vollständigen Sequenzierung der 16S rRNA-Diversität bei der Identifizierung von Organismen auf Artenebene. Aus technischer Sicht tragen mehrere Faktoren zu dieser verbesserten Leistung bei.

Technische Vorteile der vollständigen 16S rRNA-Sequenzierung

• Die vollständige Vielfalt der 16S rRNA Die in unserer Methodik verwendeten Primer umfassen alle neun variablen Regionen des 16S rRNA-Gens, wodurch die häufig mit der Primerwahl verbundene Verzerrung verringert wird.
• Die Sequenzierung erfolgt mit der PacBio Single Molecule, Real-Time (SMRT) Plattform im Circular Consensus Sequencing (CCS) Modus, was eine Sequenzgenauigkeit von über 99 % gewährleistet. Dieser Ansatz reduziert das Risiko von Fehlklassifikationen auf Gattungs- und Artenebene erheblich und verbessert die Präzision der taxonomischen Identifizierung auf Artenebene.

Abbildung 2. Struktur von 16s

Technologien der Sequenzierung der zweiten Generation erzeugen typischerweise kürzere Leseabschnitte, die nur ein bis zwei variable Regionen des 16S rRNA-Gens abdecken. Im Gegensatz dazu produziert die Plattform der dritten Generation von PacBio Langsequenzen mit einer durchschnittlichen Länge von 8 bis 15 Kilobasenpaaren (kb), die eine umfassende Abdeckung aller neun variablen Regionen ermöglichen.

Abbildung 3. Sequenzierungs-Workflow-Diagramm (Links) und PacBio-Website-Demonstration der Sequenzierungsgenauigkeit (Rechts)

Vorteile der Ergebnisse:

1. Präzise Artenidentifikation

2. Genaue Rekonstruktion der mikrobiellen Gemeinschaftszusammensetzung

Im Jahr 2019 führten Johnson et al. eine umfassende Neubewertung des taxonomischen Potenzials des 16S rRNA-Gens auf Arten- und Stammebene durch, wobei sie sowohl bioinformatische Analysen als auch Sequenzierungsexperimente verwendeten. Ihre Ergebnisse zeigten, dass das Anvisieren von Kurzlese-Sequenzierungsplattformen mit variablen Regionen des 16S-Gens nicht die taxonomische Auflösung bietet, die durch die Sequenzierung des gesamten Gens (~1500 bp) erreicht wird.

Diese Schlussfolgerung hebt eine wesentliche Einschränkung der Kurzlese-Sequenzierungsmethoden hervor, bei denen nur teilweise Regionen des Gens erfasst werden. Im Gegensatz dazu, Vollständige 16S-Sequenzierung—wie das von PacBio ermöglichte kontinuierliche Langzeit-Sequencing—ermöglicht eine viel höhere Auflösung der Differenzierung auf Arten- und Stamm-Ebene, was die Genauigkeit der Profilierung mikrobieller Gemeinschaften sicherstellt.

Die Autoren beobachteten, dass bestimmte hypervariable Regionen des 16S rRNA-Gens in der Lage waren, mikrobielle Arten in unterschiedlichem Maße zu unterscheiden (Abbildung B). Eine vollständige Sequenzierung des 16S rRNA-Gens zeigte jedoch die Fähigkeit, alle Sequenzen auf Artenebene genau zu unterscheiden. Ein Vergleich verschiedener variabler Regionen offenbarte Verzerrungen in der bakteriellen taxonomischen Klassifikation (Abbildung C).

Die Auswahl der variablen Regionen hatte einen erheblichen Einfluss auf die Anzahl der während des Clusterings generierten OTUs. Bei der Clusterung von Sequenzen mit 99 % Ähnlichkeit konnten mehrere variable Regionen die tatsächliche Anzahl der in der mikrobiellen Gemeinschaft vorhandenen Taxa nicht reproduzieren (Abbildung D).

Diese Ergebnisse heben die Einschränkungen von partiellen 16S-Sequenzierungsansätzen hervor, insbesondere in Umgebungen, in denen eine hohe taxonomische Auflösung erforderlich ist. Die Voll-Längen-16S-Sequenzierung, die alle neun hypervariablen Regionen abdeckt, bietet eine umfassendere und genauere Darstellung der mikrobiellen Vielfalt.

Anwendungsfall der Voll-Längen 16S rRNA Diversitätssequenzierung

Titel: Bakterielle Gemeinschaften von Cassiopea in den Florida Keys teilen wichtige bakterielle Taxa mit Korallen-Mikrobiomen

Veröffentlicht in: bioRxiv

Technik: Vollständige 16S rRNA Diversitätsanalyse

Im Jahr 2023 veröffentlichte unser Forschungsteam ein Preprint auf bioRxiv, in dem die PacBio Sequel-Technologie genutzt wurde, um die bakteriellen Gemeinschaften zu untersuchen, die mit Cassiopea-Medusen in den Florida Keys assoziiert sind. Die Studie hatte zum Ziel, die Dynamik dieser mikrobiellen Gemeinschaften und ihre Beziehungen zu korallenassoziierten Bakterien aufzudecken.

Durch umfassende vollständige 16S rRNA-Sequenzierung identifizierten wir signifikante bakterielle Taxa, die sowohl in Cassiopea als auch in nahegelegenen Korallenmikrobiomen verbreitet sind, wie Endozoicomonadaceae und Vibrionaceae. Unsere Ergebnisse zeigten unterschiedliche mikrobielle Zusammensetzungen zwischen den internen (gastrovasculären Höhle) und externen (Schleim) Gemeinschaften der Medusen, wobei die interne Gemeinschaft eine geringere Vielfalt aufwies im Vergleich zu den externen und umweltlichen Proben.

Wir haben auch räumliche Variationen in der Gemeinschaftszusammensetzung an verschiedenen Standorten beobachtet, was darauf hindeutet, dass Cassiopea kein striktes Kernmikrobiom besitzt, bestimmte Taxa jedoch konsequent mit diesen Medusen assoziiert sind. Dies hebt die ökologische Bedeutung dieser bakteriellen Familien und ihre potenzielle Rolle für die Gesundheit von Cassiopea hervor.

Bestellniveau-Balkendiagramme gruppiert nach Standort

Mosaikdiagramm der Dirichlet-Partition-Identität (Gemeinschaftstyp) nach Standort

Diese Studie erweitert unser Verständnis der Mikrobiome von Cnidaria und ihrer ökologischen Bedeutung und liefert grundlegende Daten für zukünftige Forschungen zu mikrobiellen Dynamiken in marinen Ökosystemen. Die Implikationen reichen bis zu Diskussionen über symbiotische Beziehungen und die Gesundheit von Ökosystemen, insbesondere im Kontext sich verändernder Umweltbedingungen.

Titel: Mikrobielle Metaboliten verbessern die Wirksamkeit der Immuntherapie durch Modulation der Stammzelligkeit von T-Zellen bei Pankrebs

Tagebuch: Zelle

Omics-Technologien: Vollständige 16S rRNA-Diversität, MetagenomikUntargetierte Metabolomik, einzelnes bakterielles Genom, Einzelzell-Transkriptomik

Im März 2024 veröffentlichte Cell eine bahnbrechende Studie, die einen neuartigen anti-krebs Mechanismus aufdeckte, der durch die Darmmikrobiota vermittelt wird. Diese Studie zeigte zunächst durch Experimente zur Fäkalienmikrobiota-Transplantation (FMT) bei Mäusen, dass das Mikrobiom des Darms einen direkten Einfluss auf die Reaktion auf die Therapie mit Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) hat.

Durch die vollständige Sequenzierung der 16S rRNA verglichen die Forscher die fecalen Mikrobiome von Mäusen, die schwache und starke Reaktionen auf die ICB-Therapie zeigten. Die Analyse auf Gattungsebene ergab eine Abnahme der Häufigkeit von Lactobacillus-Arten in der Gruppe mit schwacher Reaktion. Auf Artenebene wies Lactobacillus johnsonii die signifikanteste unterschiedliche Häufigkeit zwischen den beiden Gruppen auf (wie in der beigefügten Abbildung dargestellt).

Nachdem L. johnsonii als Schlüsselart identifiziert wurde, untersuchten die Forscher weiter seine funktionelle Rolle. Tierexperimente zeigten, dass die orale Verabreichung von L. johnsonii die Wirksamkeit der Anti-PD-1-Therapie erhöhte und den Anteil der CD8+ T-Zell-Infiltration in Tumoren steigerte. In nachfolgenden Studien, die Metabolomik, bakterielle Genomik und Einzelzell-Transkriptomik einsetzten, erforschten die Autoren, wie L. johnsonii und andere wichtige Darmmikroben die Immunantwort auf die Krebstherapie modulieren.

Die Ergebnisse bestätigten, dass L. johnsonii die Wirksamkeit von ICB verbessert, indem es die Synthese von Indol-3-propionsäure (IPA) fördert und die Aktivität von progenitor-erschöpften T-Zellen (Tpex) steigert. Diese Erkenntnisse bieten neue Einblicke, wie die Darmmikrobiota genutzt werden kann, um die Ergebnisse der Krebsimmuntherapie zu verbessern.

CD Genomics bietet ein vollständiges Angebot an Omics-Dienstleistungen, jetzt mit verbesserten Standards für die Lieferung aus einer Hand. Unser umfassendes Produktportfolio umfasst Analyse der mikrobiellen Diversität, Metagenomik, Metatranskriptomik, mikrobielle Genomik, Pflanzen- und Tierresequenzierung, Transkriptomik, prokaryotische Transkriptomik, kleine RNA-Sequenzierung, lncRNA-Analyse, Whole-Transcriptom-Sequenzierungund räumliche Transkriptomikunter anderem.

Referenzen:

1. Jia D, Wang Q, Qi Y, Jiang Y, He J, Lin Y, Sun Y, Xu J, Chen W, Fan L, Yan R, Zhang W, Ren G, Xu C, Ge Q, Wang L, Liu W, Xu F, Wu P, Wang Y, Chen S, Wang L. Mikrobielle Metaboliten verbessern die Wirksamkeit der Immuntherapie, indem sie die Stammzelligkeit von T-Zellen in Pankrebs modulieren. Zelle. 2024
2. Kaden Muffett, Jessica Labonte, Maria Pia Miglietta. Bakterielle Gemeinschaften von Cassiopea in den Florida Keys teilen sich wichtige bakterielle Taxa mit Korallen-Mikrobiomen. Biorxiv 2023