Umfassende Einblicke in die DNA-Methylierungsanalyse: Standorte, Nachweismethoden und aktuelle Forschungstrends

Was ist DNA-Methylierung?

Der Begriff DNA-Methylierung bezieht sich auf den enzymatischen Prozess, bei dem eine Methylgruppe von S-Adenosylmethionin (SAM) auf eine bestimmte Base im DNA-Molekül, Cytosin (C), Adenin (A) und Guanin (G) unter der Wirkung von DNA-Methyltransferasen übertragen wird. Dieser Prozess führt zu Veränderungen in der Chromatinstruktur, der DNA-Konformation, der DNA-Stabilität und der Wechselwirkung zwischen DNA und Proteinen, wodurch die Genexpression moduliert wird. Als relativ stabile Form der Modifikation kann die DNA-Methylierung durch DNA-Replikation unter der Wirkung von DNA-Methyltransferasen vererbt werden, was sie zu einem kritischen Mechanismus in der Epigenetik macht. Daher bietet die DNA-Methylierung eine einzigartige Methode zur Modifikation der Genaktivität, ohne die DNA-Sequenz selbst zu verändern.

Das Prinzip der DNA-Methylierung

DNA-Methylierung symbolisiert einen kritischen epigenetischen Modifikationsprozess. Dieses Verfahren wird von DNA-Methyltransferasen katalysiert, die S-Adenosylmethionin als Methylspender verwenden und es selektiv an das Cytosin in den beiden Nukleotiden des CGs der DNA anfügen. Das Hauptresultat dieses Prozesses ist die Bildung von 5-Methylcytosin. Gelegentlich führt dieser Prozess auch zur Produktion kleiner Mengen von N6-Methyladenin und 7-Methylguanin.

Im Genom sind etwa 60 % bis 90 % der CpG-Stellen Methylierung unterworfen, und die unmethylierten CpGs lagern sich zu CpG-Inseln zusammen. Interessanterweise befinden sich diese CpG-Inseln typischerweise innerhalb der Kernsequenzen von Promotoren struktureller Gene und Transkriptionsstartstellen. Diese Anordnung fügt der Landschaft der genomischen Regulation und Genexpression eine faszinierende Facette hinzu.

Bemerkenswerterweise kann die DNA-Methylierung strukturelle Veränderungen der Chromatinregionen im Genom induzieren, was zum Verschwinden von Spaltstellen für Nukleasen und Restriktionsenzyme innerhalb der DNA führt. Diese Modifikation führt dazu, dass das Chromatin stark gewunden und kondensiert wird, wodurch seine Transkriptionsaktivität verloren geht. Darüber hinaus kann die 5-Position-C-methylierte Cytosin unter dem Einfluss von Deaminierung in Thymin umgewandelt werden. Diese Transformation könnte potenziell zu Mutationen der Gen-Haplotypen und Basenfehlpaarungen, wie T2G, führen. Wenn solche Mutationen während des Zellteilungsprozesses unkorrekt bleiben, könnten sie erblich bedingte Krankheiten oder Krebs auslösen.

Es ist wichtig zu betonen, dass die Methylierung in lebenden Organismen ein stabiler und vererblicher Prozess ist. Diese Eigenschaft spielt eine entscheidende Rolle bei der Erhaltung der genetischen Stabilität und der normalen Funktionalität der Zellen.

Innerhalb der DNA eukaryotischer Organismen ist 5-Methylcytosin die einzige chemisch modifizierte Base. Die primären Methylierungsstellen sind auf die CG-Dinukleotidcluster konzentriert und zeigen eine nicht uniforme Verteilung im gesamten Genom, wodurch Bereiche mit hoher Methylierung, niedriger Methylierung und ohne Methylierung gekennzeichnet werden. Bei Säugetieren macht mC etwa 2-7% des gesamten Cytosingehalts aus. DNA-Methylierung stellt einen bedeutenden Aspekt der epigenetischen Modifikation dar, der einen Einfluss auf die genetische Expression ausübt, ohne die DNA-Sequenz selbst zu verändern. Es ist Teil der extragenetischen Kodierung und somit ein Schlüsselmechanismus der extragenetischen Vererbung.

Während der DNA-Methylierung wird eine Methylgruppe an das DNA-Molekül angefügt, beispielsweise am 5'-Kohlenstoffring der Cytosinbase. Dieses 5'-Methylierungsmuster ist bei allen Wirbeltieren zu beobachten. Ungefähr 1 % der DNA-Basen in menschlichen Zellen unterliegen einer Methylierung. In reifen somatischen Zellen erfolgt die DNA-Methylierung hauptsächlich an den CpG-Dinukleotidstellen, während nicht-CpG-Methylierung häufig in embryonalen Stammzellen beobachtet wird. Bei Pflanzen kann die Cytosin-Methylierung in Form von symmetrischem CpG (oder CpNpG) oder asymmetrischem CpNpNp auftreten (wobei C und G Basen bezeichnen, p eine Phosphatgruppe kennzeichnet und N für jedes Nukleotid steht).

Der Methylierungsstatus spezifischer Cytosine kann durch Bisulfit-Sequenzierung nachgewiesen werden. DNA-Methylierung, falls vorhanden, kann zu Genstilllegung führen und somit zu Funktionsstörungen führen. Allerdings ist DNA-Methylierung in bestimmten Arten nicht vorhanden.

Warum ist es entscheidend, DNA-Methylierung zu studieren?

DNA-Methylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Genexpression. Daher kann die Untersuchung davon zumindest wertvolle Einblicke in die Mechanismen bieten, die die Genexpression steuern. Tatsächlich ist die DNA-Methylierung an zahlreichen wichtigen biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die frühe embryonale Entwicklung, genomisches Imprinting, Inaktivierung des X-Chromosoms, das Schweigen repetitiver Sequenzen sowie den Ursprung, das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs. Eine eingehende Untersuchung der DNA-Methylierung ermöglicht es uns, die grundlegenden Mechanismen dieser lebenswichtigen Prozesse angemessener zu verstehen.

Darüber hinaus, DNA-Methylierung zeigt signifikante Anwendungen in der medizinischen Forschung, insbesondere als Biomarker für Krebs. Zum Beispiel wird die Methylierung von Septin9 umfassend als Biomarker für kolorektalen Krebs eingesetzt, unter anderem, und ihre Verwendung wird in der klinischen Praxis weithin anerkannt. Dies veranschaulicht nicht nur die potenziellen Vorteile der DNA-Methylierung bei der Krankheitsdiagnose, sondern ebnet auch den Weg für ihre breiten Zukunftsperspektiven in der medizinischen Forschung und möglichen Behandlungen.

DNA-Methylierungsmuster in normalen und Tumorgeweben

Das Ausmaß der DNA-Methylierung

Um tief in das Verständnis des Menschen einzutauchen DNA-MethylierungWir müssen die grundlegenden Verteilungseigenschaften innerhalb des menschlichen Genoms bewerten. Das Genom des Menschen umfasst etwa drei Milliarden Basenpaare, wobei etwa 28 Millionen CpG-Dinukleotide die primären Stellen der DNA-Methylierung sind. Es wird geschätzt, dass etwa 60 % bis 80 % dieser CpG-Dinukleotide methylieren. Bemerkenswert ist, dass bestimmte Bereiche wie Promotorregionen hochdichte CpG-Stellen enthalten, die als CpG-Inseln bezeichnet werden und normalerweise keine Methylierung aufweisen. In Tumorzellen hingegen sinkt das allgemeine Methylierungsniveau jedoch deutlich und liegt zwischen 20 % und 50 %. Im Vergleich zu normalen Zellen weisen etwa 10 % bis 60 % der CpG-Stellen in Tumorzellen veränderte Methylierungszustände auf, was ungefähr 2,8 Millionen bis 16,8 Millionen CpG-Stellen entspricht. Diese Veränderung deutet darauf hin, dass trotz eines Rückgangs der allgemeinen Methylierungsniveaus in Tumorzellen die Methylierungsniveaus der CpG-Stellen in den Promotorregionen der Gene tatsächlich einen klaren Anstieg zeigen.

Wie man DNA-Methylierung analysiert

Kurze Beschreibung der Methoden zur Detektion von DNA-Methylierung

Welche Technik wird verwendet, um DNA-Methylierung nachzuweisen?

DNA-Methylierungsnachweismethode im Detail

LC-MS/MS

Um den Methylierungsgrad im gesamten Genom umfassend zu bewerten, stechen zwei Methoden hervor: Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) und ELISA.

LC-MS/MS beinhaltet die enzymatische Verdauung von genomischer DNA in einzelne Nukleotide, einschließlich A, T, G, C, 5mC und 5hmC. Anschließend ermöglicht der Einsatz des massenspektrometrischen Multiple-Reaktions-Überwachungsmodus (MRM) die Quantifizierung der Häufigkeit jedes Nukleotids, wodurch der Grad der DNA-Methylierung (5mC%) bestimmt wird. Darüber hinaus kann LC-MS/MS 5hmC nachweisen. Trotz seiner hohen Genauigkeit erfordert dieses Verfahren teure Instrumente und umfasst komplexe Betriebsabläufe. Angesichts seiner Präzision und Sensitivität dient LC-MS/MS als der Goldstandard zur Bewertung des genomweiten 5mC-Gehalts.

Während die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit der Massenspektrometrie eine hohe Genauigkeit gewährleistet, stellt sie auch spezifische instrumentelle Anforderungen. Darüber hinaus führen Herausforderungen bei der Sicherstellung des Abschlusses enzymatischer Reaktionen während des enzymatischen Glykosylierungs-Radioisotopenmarkierungsprozesses zu Unsicherheiten und erhöhen die Kosten. Folglich findet diese Methode überwiegend in Forschungskontexten Anwendung.

ELISA

Durch einen antikörperbasierten Ansatz wird die Quantifizierung des 5mC-Gehalts erreicht, gekoppelt mit der Ableitung der DNA-Methylierungsniveaus (5mC%) durch Kalibrierung mit Standardkurven. Die enzymgebundene Immunadsorptionsmessung (ELISA) bietet Einfachheit und Schnelligkeit, unterstützt durch handelsübliche Testkits. In der Literatur wird jedoch angedeutet, dass diese Methode besser geeignet ist, um relativ erhebliche Unterschiede in den Methylierungsniveaus zu erkennen.

DNA-Methylierungs-Sequenzierung

Mit dem Fortschritt von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien, wir sind jetzt in der Lage, Ereignisse wie 5'-Methylcytosin und Histonmodifikationen auf der Ebene des gesamten Genoms zu analysieren. Diese Methoden eröffnen Einblicke, die über das hinausgehen, was herkömmliche genomische Studien bieten können, und läuten die Ära von "DNA-Methylierung Sequenzierung." Darüber hinaus hat der kontinuierliche Rückgang der Sequenzierungskosten und die fortlaufenden Fortschritte in den Sequenzierungstechnologien das Repertoire der verfügbaren Methoden zur DNA-Methylierungssequenzierung erheblich erweitert.

Derzeit gehören zu den verbreiteten Sequenzierungsmethoden in der epigenetischen Forschung: Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS)präzise oxidative Bisulfite-Sequenzierung (oxBS-seq)optimierte Versionen von reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS/dRRBS/XRBS), Einzelzell- oder Low-Input-Ganzgenom-Bisulfid-Sequenzierung (scWGBS), amplikonbasierte (hydroxy)methylierung Sequenzierung und (hydroxy) methylierung DNA-ImmunpräzipitationssequenzierunghMeDIP-seqDiese vielfältigen Methoden bieten maßgeschneiderte Lösungen für verschiedene Forschungsfragen zur DNA-Methylierung.

Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung

WGBS steht als der Maßstab in DNA-Methylierung Forschung, die eine präzise Erkennung des Methylierungsstatus an jeder Cytosin (C)-Base im gesamten Genom erleichtert. Diese Methode bietet eine wichtige technische Grundlage zur Aufklärung der spatiotemporalen Dynamik von genomischen DNA-Methylierungsmodifikationen und findet somit umfassende Anwendung bei der Entschlüsselung der mechanistischen Feinheiten, die der individuellen Entwicklung, dem Altern, der Krankheitsätiologie und darüber hinaus zugrunde liegen. Sie erweist sich als die bevorzugte Methode für Methylom-Studien über verschiedene Arten hinweg.

Konventionelle Methoden zur Methylierungsequenzierung des gesamten Genoms beinhalten die Verwendung von T4-DNA-Ligase, die nach der Fragmentierung von genomischer DNA durch Ultraschall die Ligation von Adaptersequenzen an beiden Enden der DNA-Fragmente ermöglicht. Eine anschließende Behandlung mit Bisulfit wandelt unmethylierte Cytosine (C) in Uracile (U) um, die anschließend durch PCR-Amplifikation, vermittelt durch Adaptersequenzen, in Thymin (T) umgewandelt werden.

Dieser Artikel über 'Wie man die Technologie zur DNA-Methylierungssequenzierung auswähltwird Ihnen helfen, die am besten geeignete Methode zur DNA-Methylierungstestung auszuwählen.

Hauptvorteile:

Breite Anwendbarkeit: Geeignet für Forschungen an Menschen sowie der Mehrheit der Tier- und Pflanzenarten (unter Berücksichtigung bekannter Referenzgenome).

Genomweite Abdeckung: Ermöglicht die umfassende Erfassung von Methylom-Daten und erleichtert die präzise Kartierung von Methylationsmustern über das gesamte Genom.

Einzelbasenauflösung: Ermöglicht die präzise Unterscheidung des Methylierungsstatus jeder einzelnen C-Base.

Vereinfachte Methylierungssequenzierung (RRBS/dRRBS/XRBS)

RRBS ist eine Strategie, die Restriktionsenzyme verwendet, um das Genom zu verdauen und bedeutende epigenetische Regulationsregionen wie Promotoren und CpG-Inseln anzureichern, gefolgt von Bisulfit-Sequenzierung. Diese Technik erhöht signifikant die Sequenzierungstiefe in hoch-CpG-reichen Regionen und ermöglicht eine hochauflösende Detektion in Regionen, die CpG-Inseln, Promotoren und Enhancer-Elemente umfassen. Als ein zuverlässiges, effizientes und kostengünstiges Werkzeug für DNA-Methylierung Forschung, sie hat großes potenzielles Anwendungsgebiet in großangelegten klinischen Stichprobenuntersuchungen. Um uns an die sich entwickelnden Anforderungen der wissenschaftlichen Technologie anzupassen, haben wir die dual-enzymatische verdauten RRBS (dRRBS) entwickelt, die CpG-Loci über größere Regionen erfassen kann, was die Erkundung umfangreicherer Methylierungsbereiche, einschließlich CGI-Küsten, erleichtert.

Um eine multidimensionale Analyse mit minimalem Probenvolumen zu erleichtern, haben wir die Extended Representation Bisulfite Sequencing (XRBS) entwickelt, eine methylierungszielgerichtete Sequenzierungsmethode, die die Abdeckung von CpG-Inseln, Promotoren, Enhancern und CTCF-Bindungsstellen anreichert. Diese Methode erreicht eine hohe Sensitivität und Wiederverwendbarkeit der Proben, was sie hoch skalierbar und anwendbar auf begrenzte Proben und Einzelzellen macht.

Technische Vorteile:

Hohe Präzision: fähig zur Einzelbasisauflösung innerhalb seines Abdeckungsbereichs.

Gute Wiederholbarkeit: Die Wiederholbarkeit des Abdeckungsbereichs über mehrere Proben kann 85%-95% erreichen, was sie für die differenzielle Analyse zwischen mehreren Proben geeignet macht.

Kostenwirksam: Der Sequenzierungsbereich zielt auf hoch-CpG-reiche Regionen ab und optimiert damit die Datennutzung.

Einzelzell-Ganzgenom-Bisulfid-Sequenzierung (scWGBS)

Die Untersuchung der DNA-Methylierungsgenomik in Einzelzellen und winzigen Proben wird oft durch die Sequenzierungstechniken der Bibliotheken eingeschränkt. Traditionelle Methoden zur Bibliothekskonstruktion und Techniken zur Amplifikation von Einzelzellgenomen sind schwierig in den Protokollen zur Methylierungsexperimentierung anzuwenden. Mit einer Technologie, die auf linearer Amplifikation und der Konstruktion von Bibliotheken in einem einzigen Röhrchen basiert, hat unser Team erfolgreich die Bibliotheksverzerrung reduziert und präzise umfassende Methylierungsstudien im gesamten Genom in wertvollen Proben abgeschlossen.

Die Forschung zur Methylierung von Einzelzellen und extrem seltenen Proben wird hauptsächlich zur Untersuchung der Mechanismen der Tumorentwicklung, der Krebsforschung, der Präimplantationsdiagnose von Embryonen, der frühen embryonalen Entwicklung, der Keimbahnzell-Rekombination, von Stammzellen und der zellulären Heterogenität angewendet, unter anderem. Die anwendbaren Proben umfassen Einzelzellen und Mikrozellen.

Technische Vorteile:

Minimale Ausgangsmaterialien: Verwendet Einzelzellen oder extrem minimale Ausgangs-DNA für den Bibliotheksaufbau.

Hohe Sequenzierungsabdeckung: Maximiert die Extraktion umfassender Informationen zur gesamten Genom-Methylierung und kartiert präzise die Methylierungslandschaft.

Einzelbasisauflösung: In der Lage, den Methylierungsstatus jeder Cytosin-Basis genau zu analysieren.

Präzise oxidative Bisulfit-Sequenzierung (oxBS-Seq)

DNA-Hydroxymethylierung wurde kürzlich als eine innovative Art der DNA-Modifikation identifiziert, die schnell zu einem wichtigen Forschungsschwerpunkt geworden ist. Durch aufschlussreiche Forschung wurde offenbart, dass die Bisulfit-Sequenzierung, die zuvor als der "Goldstandard" zur Erkennung von DNA-Methylierung angepriesen wurde, nicht in der Lage ist, zwischen DNA-Methylierung (5mC) und DNA-Hydroxymethylierung (5hmC) zu unterscheiden. Gemeinsam haben YeeGene und die Universität Cambridge eine oxBS-Seq das nicht nur DNA-Methylierung genau erkennen kann, indem es den Einfluss der DNA-Hydroxymethylierung einschränkt, sondern auch gleichzeitig DNA-Hydroxymethylierung mit Einzelbasenauflösung feststellen kann, indem es eine Dual-Bibliothekskombination nutzt.

Technische GrundsätzeoxBS-Seq oxygeniert 5hmC zu 5fC, das dann durch Bisulfid in 'U' umgewandelt werden kann, wodurch eine präzise Erkennung von 5mC ermöglicht wird. Gleichzeitig kann durch den Vergleich mit routinemäßigen Bisulfid-Ergebnissen eine genaue Erkennung von 5hmC erreicht werden.

Technische Vorteile: Neuinterpretation des "Goldstandards" in der DNA-Methylierungsdetektion Analyse von DNA-Hydroxymethylierungsmodifikationen mit Einzelbasenauflösung Multi-Standard-Validierung zeigt hohe Oxidationseffizienz und Bisulfit-Umwandlungsrate Minimale experimentelle Verzerrung mit außergewöhnlicher Reproduzierbarkeit (R² > 0,98) In der Lage, eine Vielzahl von Sequenzierungsanwendungsbedürfnissen zu berücksichtigen: optimierte oxidative reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (oxRRBS), gezielte regionale oxidative Methylierungssequenzierung (Target-oxBS).

OxBS-seq zeigt nur 5mC an und erfordert einen Vergleich mit der Standard-Bisulfid-Sequenzierung (BS-seq), um die Sequenzpositionen und die Häufigkeit von 5hmC und 5mC abzuleiten. (Tibor A. Rauch et al.) Handbuch der Epigenetik, 2023)

Amplicon-Methylierung (Hydroxymethylierung) Sequenzierung

Amplicon-basierte Methylierungs- und Hydroxymethylierungssequenzierung zielt auf spezifische DNA-Sequenzen im Genom ab, indem methylierungsspezifische Amplifikationsprimer verwendet werden, wie sie für bestimmte Gene von Interesse relevant sind. Nach der (oxidativen) Bisulfidbehandlung von genomischer DNA erfolgt die Amplifikation mittels PCR, bevor das Methylierungsprofil innerhalb der Genregionen mit einem außergewöhnlichen Maß an Genauigkeit erstellt wird, unterstützt durch Next-Generation-Hochdurchsatzsequenzierung.

Technische Vorteile:

Hohe Genauigkeit: Diese Technik ist in der Lage, einige bis mehrere hundert Gene/CpG-Stellen zu analysieren und erreicht eine Auflösung auf Einzelbasenpaar-Ebene im angestrebten Bereich. Sie bietet zudem eine überlegene Abdeckungsdichte (durchschnittliche Standortabdeckung >300X).

Kosteneffektiv: Diese Technik bietet eine niedrige Kosten und eine schnelle Durchlaufzeit und vereint herausragende wirtschaftliche Effizienz mit wissenschaftlichem Wert.

Spezifität: Geeignet zur Erkennung von Methylierungszuständen an spezifischen Genen oder Stellen.

Breite Anwendbarkeit: Es wird häufig in klinischen Proben für das Screening, die Validierung und die translationale klinische Anwendung von Methylierungsbiomarkern eingesetzt.

hMeDIP-Seq

hMeDIP-seq, ein Begriff, der sich aus der Methylierung von DNA ableitet, bezieht sich auf die innovative Basismodifikation 5hmC, die durch die Oxidation von 5mC durch das von der TET-Familie produzierte Enzym entsteht. 5hmC hat nicht nur das Potenzial, zur Kontrolle der Genexpression beizutragen, indem es die Affinität zwischen der methylierte DNA und der Methyl-CpG-Bindungsdomäne (MBD) des MeCP-Proteins verringert, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle im Prozess der DNA-Demethylierung.

Die hMeDIP-Seq-Technik funktioniert, indem sie einen spezifischen Antikörper gegen 5'-Hydroxymethylcytosin nutzt, um hydroxymethylierte DNA-Fragmente anzureichern. Dieser Prozess wird dann mit Hochdurchsatz-Sequenzierung kombiniert, um schnell und effizient hydroxymethylierte Regionen im gesamten Genom mit einem kleineren Datensatz zu lokalisieren. Ihre Anwendbarkeit ist weitreichend und erstreckt sich auf die Untersuchung der Beziehung zwischen Hydroxymethylierung und Krankheit sowie ihrer Rolle in der embryonalen Entwicklung.

Diese Technologie bietet zahlreiche Vorteile: einen breiten Erkennungsbereich, der die Identifizierung von methylierungsmodifizierten Bereichen im gesamten Genom ermöglicht; eine hohe Spezifität, die eine gezielte Erkennung von Regionen mit methylierungsmodifikationen im Genom erlaubt; und einen kosteneffizienten Vorteil durch ein reduziertes Sequenzierungsdatenset, was die Sequenzierungskosten senkt.

EM-seq

Was die enzymatische Methyl-seq (EM-seq) betrifft, so mildert sie eine wesentliche Einschränkung des langjährigen Goldstandards für die Methylom-Analyse, WGBSDie chemischen Reaktionen von Bisulfit beeinträchtigen die DNA-Integrität, was zu DNA-Fragmente und Verlust führt. EM-seq überwindet diesen Nachteil durch enzymatische Verarbeitung von DNA zur Konstruktion von WGBS-Bibliotheken. Im ersten Schritt verwandeln das TET2-Enzym und oxidationsfördernde Mittel 5mC und 5hmC in 5-Carboxylcytosin (5caC) und schützen somit modifizierte Cytosine. In der zweiten Phase behandelt die Deaminase APOBEC Cytosine, ohne 5caC zu beeinträchtigen, wodurch die Detektion von 5mC und 5hmC ermöglicht wird.

Pyrosequenzierung

Die Pyrosequenzierung, auch bekannt als synthetische Sequenzierung, verwendet die Bisulfit-Konversion gefolgt von Pyrosequenzierung, um DNA-Veränderungen in spezifischen Zielbereichen nach der Konversion mit Bisulfit zu erkennen. Die Quantifizierung der 5mC-Spiegel erfolgt durch den Vergleich des Verhältnisses von Cytosin (C) zu Thymin (T) an einzelnen Genloci. Diese Sequenzierungstechnik erfordert keine spezielle Form der Fluoreszenzmarkierung oder Elektrophorese und bietet eine einfache Handhabung. Mit einer Wiederholbarkeit und Genauigkeit der Sequenzierung, die mit der Sanger-Sequenzierung vergleichbar ist, kann die Pyrosequenzierung die hundertfache Geschwindigkeit erreichen. Allerdings schränkt die Abhängigkeit der Technik von der Erkennung von sofortiger Lumineszenz ihren höheren Durchsatz ein, und ihre Präzision bei der Erkennung von Homopolymeren ist suboptimal. Mit zunehmender Länge des Homopolymers steigt entsprechend das Fehlerpotenzial. Die Pyrosequenzierung ist am besten geeignet für die schnelle Sequenzierung kurzer, bekannter DNA-Sequenzen im Bereich von 20 bis 50 Basenpaaren.

TET-unterstützte Pyridinboran-Sequenzierung

TET-unterstützte Pyridinboran-Sequenzierung (TAPS) bietet einen innovativen Wandel vom konventionellen Rahmen der Umwandlung mit Bisulfitsalzen. TAPS wählt einen direkteren Ansatz und wandelt methylierte Cytosine (C) vor der Sequenzierung in Thymin (T) um. Die Umwandlung von C zu T erfolgt durch eine Kombination aus enzymatischen und chemischen Reaktionen. Zunächst wandelt das TET1-Oxidationsenzym 5mC und 5hmC in 5-Carboxylcytosin (5caC) um. Anschließend wird dies durch die Wirkung des Reduktionsmittels Pyridinboran in Dihydrouracil (DHU) umgewandelt, eine Verbindung, die als PCR-Template dient. Die DNA-Polymerase, die Uracil (U) erkennen kann, erkennt DHU. Folglich wird nach dem PCR-Prozess ein PCR-Produkt erzeugt, das eine Umwandlung von C zu T durchlaufen hat.

TAPS bietet einen klaren Vorteil.: sein nicht-destruktiver Ansatz gegenüber DNA. Es reduziert den DNA-Verlust und erhöht damit die Komplexität oder Abdeckung der Sequierungsdaten. Nach der Umwandlung können DNA-Fragmente von bis zu 10 Kilobasen erhalten bleiben, was TAPS für die Sequenzierung der dritten Generation äußerst anwendbar macht. Angesichts seiner Methode, methylierte Cytosine in Thymin umzuwandeln, ist der Einfluss auf das Basenverhältnis der DNA-Sequenz äußerst minimal, was die Qualität der nachgelagerten Daten verbessert und die Datenanpassungsraten erheblich erhöht. Darüber hinaus erweist sich die Kosteneffektivität der TAPS-Technik als überlegen gegenüber den traditionellen Bisulfit-Umwandlungsmethoden.

Nanoporen-Sequenzierung

Die Nanoporen-Sequenzierungstechnologie nutzt die potenziellen Unterschiede, die entstehen, wenn einzelne Moleküle durch Nanoporen hindurchgehen, um Signale zu detektieren. Der Durchmesser einer Nanopore ist nur ausreichend, um den Durchgang eines einzelnen Nukleinsäurepolymers zu ermöglichen. Die vier Nukleobasen Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G) - einschließlich derjenigen, die mit Methylierungsmodifikationen versehen sind - weisen jeweils unterschiedliche Ladungseigenschaften auf. Folglich zeigen Nukleotide mit Methylierungsmodifikationen und ihre unmodifizierten Gegenstücke unterschiedliche elektrische Signalmerkmale, während sie die Nanopore durchqueren. Daher können fortschrittliche Computermodelle wie Deep Learning die charakteristischen elektrischen Signal Muster von methylieren Molekülen erfassen, was den Weg für die Schaffung von Werkzeugen ebnet, die in der Lage sind, DNA/RNA-Molekül-Methylierungsmodifikationen basierend auf ONT-Sequenzierungssignalen zu erkennen.

DNA-Methylierungs-Chip

In großem Maßstab, das gesamte Genom DNA-Methylierung Studien zeigen, dass die DNA-Methylierungschip-Methode im Vergleich zu WGBS aufgrund der hohen Kosten, die mit der Sequenzierung und Datenverarbeitung verbunden sind. Ein DNA-Methylierungschip beinhaltet die Hybridisierung eines bisulfidbehandelten DNA-Sondes, die in cytosinreiche CpG-Loci von Interesse (sowohl methyliert als auch unmethyliert) umgewandelt wird.

Der 450K-Chip führt eine Bisulfit-Konversion an 0,5-1 μg genomischer DNA durch. Die konvertierte DNA hybridisiert dann mit einem Array von zwei vordefinierten, methylierungsspezifischen Sonden: methylierte und unmethylierte. Die einzelne Base der Sonde bindet an markierte und fluoreszenzgefärbte Nukleotide (ddNTP) an der 3' CpG-Stelle. Der Bead-Chip wird dann auf einem Illumina iScan gescannt, um das Verhältnis der fluoreszierenden Signale zu erfassen. Der DNA-Methylierungsanteil an jeder CpG-Stelle wird als β-Wert (β) bezeichnet, der als M/(M+U+100) berechnet wird, wobei M die Stärke des Methylierungssignals, U die Stärke des unmethylierten Signals und 100 ein konstanter Offset ist, der verwendet wird, um die β-Werte anzupassen, wenn die Intensitäten sowohl der methylierte als auch der unmethylierte Cytosine niedrig sind. Ein β-Wert von 0 bedeutet 0% Methylierung, und 1 zeigt 100% Methylierung an der Ziel-CpG-Stelle an.

Die Methylierungschip-Technologie hat sich als ein wichtiges Werkzeug in der Forschung zur DNA-Methylierung etabliert. Im Vergleich zur Methylierungssequenzierung des gesamten Genoms bietet die Chip-Detektion niedrigere Anforderungen an die Initiierung, kürzere Zyklen und die Möglichkeit, die Einschränkungen des Proben Typs zu umgehen, wodurch sie sich auch für Formalin-fixierte, paraffineingebettete (FFPE) Proben und wertvolle klinische Proben eignet. Solche Vorteile haben die Technologie zu einem "Renner" im Bereich der Methylierungsdetektion gemacht. Geräte wie der Infinium Human Methylation 450 und Methylation EPIC v1.0 (850K) wurden in veröffentlichten Studien weitreichend für die Sammlung von epigenomweiten Assoziationsdaten genutzt, wobei ein stetig steigender Trend von Jahr zu Jahr zu beobachten ist.

Gen-spezifischer Ansatz

Methylierungs-spezifische PCR, MSP

MSP ermöglicht eine schnelle qualitative Bewertung des Methylierungsstatus in jeder Gruppe von CpG-Stellen innerhalb von CpG-Inseln. Der Hauptvorteil von MSP liegt in seiner Einfachheit und Schnelligkeit. Wenn das Ziel eine relative Quantifizierung ist, kann man fluoreszierende Farbstoffmarkierungen verwenden und durch die qMSP-Methodik direkt Fluoreszenzwerte und Ct-Werte ablesen, um die Methylierungsniveaus darzustellen.

Das Prinzip von MSP (J G Herman et al., 1996)

MethyLight

Darüber hinaus könnten Methoden, die auf fluoreszierenden Sonden basieren, wie MethyLight, eingesetzt werden. Methylierungsspezifische Primer sind am 5'-Ende mit der fluoreszierenden Gruppe FAM konjugiert, während unmethylierungsspezifische Primer am 5'-Ende mit VIC, einer anderen fluoreszierenden Gruppe, konjugiert sind. Die Echtzeit-PCR gibt konstante Ströme von FAM und VIC ab, wodurch die Identifizierung von Methylierungszuständen durch die Detektion dieser beiden ermöglicht wird. Der Grad der Methylierung wird quantitativ durch die Messung der Ct-Werte bestimmt. Jede PCR-Reaktion benötigt weniger als 100 ng bisulfit-konvertierte DNA, während die quantitativen Ergebnisse unter Verwendung von Standardprodukten berechnet werden können.

Prinzip von MethyLight (Anetta Sulewska) u. a.,. 2007)

dPCR

Die digitale Polymerase-Kettenreaktion (dPCR) ist ein sich schnell entwickelndes Verfahren zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuren, das auf Prinzipien der Einzelzählung basiert. Es wird zunehmend zur Quantifizierung von Spuren- oder Niedrigmethylierungsproben eingesetzt. Die Nutzung dieser Methode zur Methylierungsdetektion bietet mehrere deutliche Vorteile, darunter:

1) Hohe Empfindlichkeit: dPCR ermöglicht die direkte Methylierungsdetektion auf Einzelmolekülebene innerhalb eines umfangreichen Arrays von Mikro-Reaktionseinheiten, wodurch die Notwendigkeit für Subklonierungsvektoren, die beim Sanger-Sequenzieren erforderlich sind, umgangen wird. Dies ist besonders geeignet zur Detektion von Proben mit geringer Häufigkeit oder seltenen Methylierungsstellen.

2) Direkte Quantifizierung: Im Gegensatz zu MethyLight entfällt bei dPCR die Notwendigkeit, Standardkurven zu erstellen. Es quantifiziert direkt die Kopienzahlkonzentrationen von methylierten DNA-Proben, was zu Quantifizierungsergebnissen führt, die weniger von der Effizienz der PCR-Amplifikation beeinflusst werden.

3) Robuste Störfestigkeit: Durch die gleichmäßige Verteilung der Probe in Tausenden von Mikro-Reaktionseinheiten werden PCR-Inhibitoren, die in den Proben vorhanden sind, erheblich verdünnt, wodurch die Störung der PCR-Reaktionen minimiert wird.

Angesichts dieser Eigenschaften ist die digitale PCR besonders gut geeignet für das Screening und die Validierung von Methylierungsniveaus in Spuren-DNA-Proben innerhalb komplexer Matrizen, wie zum Beispiel paraffineingebetteten Proben oder zellfreier zirkulierender DNA (cfDNA), die aus Plasma gewonnen werden. Folglich nehmen immer mehr Forscher digitale PCR-Techniken zur DNA-Methylierungsdetektion an.

Digitale MethyLight-basierte Echtzeit-PCR-Amplifikation. (Daniel J Weisenberger) u. a.,. 2008)

Methylierungsrestriktionsenzymverdau

Dieses Verfahren nutzt die Eigenschaft von methylierungsrestriktiven Endonukleasen, methylierte Regionen unverdaut zu lassen, wodurch DNA in unterschiedliche Segmentgrößen zerbrochen wird, die für die anschließende Analyse verwendet werden. HpaII-MspI, das die Sequenz CCGG erkennt, ist ein repräsentatives Enzym-Paar, das üblicherweise für diese Aufgabe eingesetzt wird. Anschließend werden die isolierten Produkte einer Southern-Blot-Analyse oder PCR-Amplifikation unterzogen, um den Methylierungsstatus der Zielfragmente zu bestimmen.

Methylierte und nicht-methylierte Sonden, die jeweils mit Oligonukleotidabschnitten entworfen wurden, die Hybridsequenzen unterschiedlicher Länge enthalten, werden separat mit der Test-DNA hybridisiert. Die an die DNA gebundenen Sonden sind durch eine Ligase verknüpft. Wenn Methylierungsstellen im DNA-Fragment vorhanden sind, kann die Sonde mit der HpaII-Erkennungsstelle nicht geschnitten werden. Im Gegensatz dazu wird, wenn die DNA nicht-methylisiert ist, das Fragment von HpaII geschnitten und die Sonde kann nicht verknüpft werden. Daher können im anschließenden PCR-Amplifikationsprozess nur die verknüpften Sonden amplifiziert werden. Die endgültige Analyse der amplifizierten Fragmente zeigt den Methylierungszustand spezifischer Stellen in der ursprünglichen DNA.

Diese Methode bietet mehrere Vorteile: Erstens ist das erforderliche Probenvolumen minimal. Aufgrund der kurzen Erkennungssequenzen der Sonden ist diese Methode für lokoregional zersetzte DNA geeignet, wie zum Beispiel DNA-Proben, die in Paraffin eingebettet sind. Sie ist auch anwendbar für die Analyse großer Mengen gemischter Proben. Die Einschränkung dieser Methode liegt darin, dass die Verknüpfungsstelle der Sonde durch die Erkennungsstelle des Restriktionsendonukleasen eingeschränkt ist. Darüber hinaus muss die optimale Reaktionstemperatur des verwendeten Enzyms berücksichtigt werden.

Methylierungs-spezifische multiplex Ligation-abhängige Sondenamplifikation (MS-MLPA)
(Cornelia Hömig-Hölzel u. a.,. 2012)

HRM

Die Hochauflösende Schmelzanalyse (HRM) wurde zunächst zur Genotypisierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) eingesetzt und wurde erweitert, um Methylierungsveränderungen in DNA zu erkennen, die einer Bisulfitbehandlung unterzogen wurden. Durch die Verwendung spezifischer fluoreszierender Farbstoffe identifiziert sie die Unterschiede in einzelnen Basen anhand ihrer unterschiedlichen Denaturierungseigenschaften. Die subtilen Unterschiede zwischen 5-Methylcytosin und Cytosin zeigen sich als Einzelbasisveränderungen in der DNA nach der Behandlung mit Natriumbisulfit. Die Methylierungsniveaus der Testproben können geschätzt werden, indem ihre Denaturierungskurven mit einer Reihe von Kontrollkurven verglichen werden, die aus Proben mit bekannten Prozentsätzen an Methylierung und Nicht-Methylierung erstellt wurden. Dies kann durch das sorgfältige Design von Primern erreicht werden, um PCR-Bias zu minimieren.

Schematische Darstellung der Hochauflösungs-Schmelzkurven (HRM) zur Erkennung von Methylierung (Dianna Hussmann.; Lise Lotte Hansen. 2018)

Affinity-Anreicherung

Affinity-Anreicherungstechniken, einschließlich der Methylierte DNA-Immunpräzipitation (MeDIP) und der Methylbindungsdomänen-Protein-Auffangung (MBD Cap), spielen eine bedeutende Rolle in DNA-Methylierung Die MeDIP-Technik verwendet einen spezifischen Antikörper gegen 5-Methylcytosin, um methylierte Fragmente nach der DNA-Fragmente und Denaturierung anzureichern. Die immunopräzipitierten Fragmente können nach Isolation und Reinigung sequenziert werden, um weitere Analysen durchzuführen. Die MBD Cap-Technik, ähnlich wie MeDIP, nutzt DNA-Methylierungs-bindende Proteine für die Immunpräzipitation von methylierter DNA. Obwohl sie ähnlich sind, unterscheiden sich die angereicherten Proteine darin, dass MeDIP im Allgemeinen auf hypomethylierte Regionen mit niedriger CpG-Dichte abzielt, während MBD Cap typischerweise hochmethylierte Regionen mit hoher CpG-Dichte anreichert. Diese Variationen machen beide Techniken in ihren einzigartigen Anwendungen in der Forschung zur DNA-Methylierung von unschätzbarem Wert.

Affinity-basierte Methoden. MeDIP: Methylierte DNA-Immunpräzipitation; MIRA: Assay zur Rückgewinnung von methylierter CGI; MBD: Methyl-bindende Domäne. (Kristen Taylor) u. a.,. 2010)

MassArray

Das MassARRAY-Genanalyse-System kombiniert die Prinzipien der basenspezifischen enzymatischen Spaltungsreaktion (MassCLEAVE) und der MALDI-TOF-Sequenzierung. Ähnlich wie andere Methoden zur Erkennung von DNA-Methylierung verwendet die MassARRAY-Plattform sulfitiertes DNA, wobei un-methylierte Cytosine (C) in Uracil (U) umgewandelt werden, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Methylierte und un-methylierte Cytosine (in U umgewandelt) können aufgrund ihrer unterschiedlichen Molekulargewichte unterschieden werden. Die resultierenden Produkte mit unterschiedlichen Molekulargewichten werden transkodiert und unterziehen sich einer basenspezifischen enzymatischen Spaltungsreaktion (MassCLEAVE). Die Molekulargewichte der methylisierten und nicht-methylisierten Fragmente sind unterschiedlich (unterschieden basierend auf dem 16Da-Molekulargewichtsunterschied zwischen der Base G und der Base A), was die Berechnung des Methylierungsverhältnisses durch Zeitflug-Massenspektrometrie ermöglicht. MassARRAY bietet eine hohe Durchsatzrate, niedrige Kosten und hohe Sensitivität. Allerdings ist spezielle Ausrüstung erforderlich, und es kann unbekannte Mutationen nicht erkennen. Darüber hinaus erfordert es eine Umwandlung und PCR-Amplifikation, und jeder Test hat spezifische Anforderungen hinsichtlich der Proben- und Standorteanzahl.

Sequenom MassARRAY-Technologie zur Analyse der DNA-Methylierung (Enrique J. Busó) u. a.,. Epigenetische Biomarker und Diagnostik 2016)

Anwendung der DNA-Methylierungsforschung

Fundamentale Forschung: Fokus auf die Krankheitsentstehung

a. Krebs: Veränderungen der Methylierungslevels zahlreicher tumorrelevanter Gene führen zu einer Genstilllegung oder Überexpression, was zur Tumorentstehung beiträgt. Zum Beispiel kommt es bei Brustkrebs häufig zu Veränderungen bei Tumorsuppressorgenen wie BRCA1 und TP53. DNA-Methylierung, was zu reduzierter oder verlorener Genexpression führt und somit das Risiko der Tumorentstehung erhöht. Darüber hinaus sind abnormale DNA-Methylierungsniveaus eng mit der Malignität und Prognose von Tumoren verbunden. Studien haben gezeigt, dass hochmethyliertes Tumorgewebe im Allgemeinen schlechtere Überlebensraten und höhere Metastasierungsrisiken aufweist als Gewebe mit niedrigeren Methylierungsniveaus. Daher hat die DNA-Methylierung erhebliche Implikationen für das frühe Screening und die Diagnose von Krebs.

b. Herz-Kreislauf-Erkrankungen: Dysregulierte Expression von methylierten Genen und Veränderungen der DNA-Methylierungslevels stehen in engem Zusammenhang mit dem Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie Bluthochdruck, koronare Herzkrankheit und Myokardinfarkt.

c. Genetische Störungen: Einige monogene Erbkrankheiten wie Mukoviszidose und Hämophilie können durch Methylierung diagnostiziert werden.

d. Psychische Störungen: DNA-Methylierung könnte auch an der Pathogenese von psychischen Störungen wie Autismus und Schizophrenie beteiligt sein.

e. Autoimmunerkrankungen: Studien deuten darauf hin, dass die DNA-Methylierung eine Rolle bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis und systemischem Lupus erythematodes spielen könnte.

Translationale medizinische Forschung: Fokus auf Krankheitsbiomarker

a. Krebsdiagnose: DNA-Methylierung stellt einen entscheidenden Bereich in der Krebsforschung dar, der durch einzigartige Methylierungsmuster in verschiedenen Krebsarten gekennzeichnet ist. Die Bewertung des DNA-Methylierungsstatus in Krebsgeweben kann für die frühzeitige Diagnose, die Prognosebewertung und die Überwachung von Rückfällen genutzt werden. Beispielsweise kann bei Lungenkrebs, Darmkrebs, Brustkrebs und anderen bösartigen Erkrankungen die Vorhersage der Überlebensraten von Patienten und der Rückfallrisiken durch die Erkennung des Methylierungsstatus in spezifischen Genen erreicht werden.

b. Erkennung genetischer Krankheiten: Die DNA-Methylierung findet Anwendung bei der Erkennung genetischer Krankheiten. Zum Beispiel hilft die Untersuchung des Methylierungsstatus bestimmter Gene bei der Diagnose und dem Screening von monogenen Erbkrankheiten wie Mukoviszidose und Hämophilie.

c. Erkennung von psychischen Störungen: Forschungen deuten auf eine potenzielle Verbindung zwischen DNA-Methylierung und dem Auftreten von psychischen Störungen wie Autismus und Schizophrenie hin. Die Profilierung des DNA-Methylierungsstatus von Personen mit psychischen Störungen trägt zu einem tieferen Verständnis ihrer Pathogenese bei und bietet somit neue Erkenntnisse und Ansätze für Diagnose und Behandlung.

Im Bereich der Tier- und Pflanzenzucht wurden bedeutende Fortschritte erzielt, die auf den Fortschritten in der Molekularbiologie und Umweltwissenschaft basieren.

Im Bereich der Tier- und Pflanzenzucht:

Grundlagenforschung: Die Untersuchung der Methylierungsmuster von Arten und deren Zusammenhang mit verschiedenen biologischen Phänomenen wie Wachstum, Entwicklung, Krankheitsresistenz, Fortpflanzungsfähigkeiten, frühzeitiger embryonaler Entwicklung und Seneszenz bildet einen Grundpfeiler.

Molekulare Marker: Die Nutzung von DNA-Methylierung als molekularen Marker erleichtert Züchtern die Auswahl von Individuen, die wünschenswerte Eigenschaften wie Krankheitsresistenz, Schädlingsresistenz und hohe Produktivität aufweisen.

Genom-Editing: Die Modulation der Methylierungsmuster von Tier- und Pflanzengenomen ermöglicht eine präzise Regulierung der Genexpression, wodurch gewünschte Eigenschaften in diesen Organismen verbessert werden.

Wenden wir uns dem Umweltaspekt zu:

Phytoremediation: Bestimmte Pflanzenarten besitzen die Fähigkeit, Schadstoffe anzureichern. Durch die Manipulation des Methylierungsstatus dieser Pflanzen kann ihre Fähigkeit, Schadstoffe aufzunehmen und abzubauen, erhöht werden, was die Phytoremediation unterstützt.

Mikrobielle Abbau: Die Nutzung des mikrobiellen Abbaus organischer Schadstoffe stellt einen entscheidenden Ansatz in der Umweltremediation dar. Die Manipulation des Methylierungsstatus von Mikroorganismen kann ihre Fähigkeit zur Abbau von Schadstoffen erhöhen.

Molekulare ökologische Studien: Die Erforschung der DNA-Methylierung zur Aufklärung der Struktur, Funktion und Sukzessionsmuster von mikrobiellen Gemeinschaften in verschmutzten Umgebungen trägt zu einem umfassenden Verständnis der ökologischen Eigenschaften verschmutzter Umgebungen bei und bietet eine theoretische Grundlage für Strategien zur Schadstoffbewirtschaftung.

Referenzen:

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