oxBS-Seq, eine epigenetische Sequenzierungsmethode zur Unterscheidung von 5mC und 5hmC

Um zwischen 5-Methylcytosin (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu unterscheiden, oxidative Bisulfite-Sequenzierung (oxBS-Seq)) bietet eine zusätzliche oxidative Stufe für Bisulfit. Zunächst wird 5hmC in genomischer DNA zu 5-Formylcytosin (5fC) oxidiert. Im Gegensatz zu 5mC und 5hmC ist 5fC empfindlich gegenüber der Bisulfit-Deaminierung, sodass die Behandlung von oxidierter DNA mit Bisulfit 5fC in Uracil umwandelt. Die in der Sequenz verbleibenden Cytosine waren 5mC und nicht 5hmC, was durch Next-Generation-Sequencing ermittelt wurde. Die parallele Identifizierung von 5mC und 5hmC erfolgt in einem Standard-Bisulfit-Lauf. Die Beteiligung von 5hmC kann durch den Vergleich dieser beiden Sequenzen abgeleitet werden. Der Hauptvorteil von oxBS-Seq gegenüber enzymatischen Methoden wie TAB-seq besteht darin, dass oxBS-Seq kein stark engagiertes TET-Enzym erfordert, das kostspielig und nur etwa 95% effektiv ist.

Abbildung 1. Quantitative Sequenzierung von 5-Formylcytosin in DNA mit Einzelbasenauflösung. (Booth, 2014)

Vorteile und Nachteile der oxidativen Bisulfit-Sequenzierung

Es gibt drei Hauptvorteile von oxBS-Seq. Diese umfassen (1) CpG- und non-CpG-Methylierung mit einer Einzelbasisauflösung im gesamten Genom, (2) die Abdeckung von 5mC in dichten und weniger dichten Wiederholungsbereichen und (3) die klare Unterscheidung zwischen 5mC und 5hmC.

Aber oxBS-Seq hat auch seine Nachteile. Die beiden bestehenden Nachteile sind (1) ein signifikanter DNA-Verlust (99,5 Prozent), der aus schweren Oxidationsbedingungen resultieren kann, und (2) es muss integriert werden mit Bisulfitsequenzierung (BS-Seq) C, 5mC und 5hmC unterscheiden und bewerten.

Prinzipien von oxBS-Seq

5mC ist ein epigenetisches DNA-Symbol, das mit CpG-Dinukleotiden angereichert ist und eine wesentliche Rolle bei der Genstilllegung und der Genomstabilität spielt. 5mC ist ein beliebtes epigenetisches Merkmal mit bedeutenden Mechanismen in Wachstum, Transposon- und Genstilllegung, genomischer Prägung, Hemmung der X-Chromosomen und der Nachhaltigkeit des Genoms. Bei vielen menschlichen Erkrankungen, wie Krebs, bei denen grobe Hypomethylierung von Hypermethylierung innerhalb bestimmter CpG-Inseln gefolgt wird, ist anormaler DNA-Methylierung beteiligt.

Die Ten-eleven Translokation (TET) Enzymfamilie kann 5mC in 5hmC oxidieren. Bei der aktiven DNA-Demethylierung kann 5hmC eine Alternative darstellen, könnte aber auch ein epigenetisches Merkmal an sich beinhalten. Durch analytische Techniken können Raten von 5hmC in genomischer DNA berechnet und durch die Anreicherung von 5hmC-haltigen DNA-Abschnitten, die dann sequenziert werden, dargestellt werden. Solche Methoden haben vergleichsweise eine niedrige Auflösung und liefern nur relativ quantifizierbare Informationen. Mit BS-Seq wurde die Einzel-Nukleotid-Sequenzierung von 5mC durchgeführt, jedoch kann 5mC von 5hmC mit dieser Technik nicht unterschieden werden. Derivatisiertes 5hmC in genomischer DNA kann nachgewiesen werden durch Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung (SMRT). Die Verbesserung von DNA-Fragmenten, die 5hmC beinhalten, ist jedoch notwendig, was zu einem Versagen der quantitativen Daten führt. Darüber hinaus weist SMRT eine signifikant hohe Rate an Sequenzierungsfehlern auf, und die Modifizierung der Peak-Bestimmung ist ungenau. 5mC von 5hmC kann durch Proteine und Festkörper gelöst werden. Nanoporen und kann unamplifizierte DNA sequenzieren.

Durch extrem selektive chemische Oxidation von 5hmC zu 5fC unterscheidet oxBS-Seq zwischen 5mC und 5hmC. Die Methode nutzt auch die bisulfitspezifische Unterscheidung in der Reaktivität zwischen 5hmC und 5fC. Die Bisulfitbehandlung führt dazu, dass 5fC deformyliert und deaminiert wird, um Uracil zu erzeugen (das in der Sequenzierungsphase als Thymin gelesen wird), im Gegensatz zu 5hmC, das nicht deaminiert wird. Somit ist nach oxBS-seq die einzige Base, die nicht deaminiert und daher als Cytosin gelesen wird, 5mC. Entsprechend bietet diese Strategie einen zuverlässigen Überblick über das gesamte aktuelle 5mC. Durch die Durchführung von BS-seq und die Auswertung seiner Ergebnisse mit denen von oxBS-seq wird die anschließende Identifizierung von 5hmC erreicht.

Anwendungen und Forschungsfortschritt

Zusammen mit einer Vielzahl von bereits etablierten Analysetechniken für BS-seq, wie DNA-Sequenzierung und Methylierungsarrays, kann der oxBS-seq-Prozess verwendet werden, um DNA zu verändern. Diese Technik ist systemunabhängig, wenn sie in Verbindung mit Next-Generation-Sequencing eingesetzt wird, und eignet sich zur Bewertung von 5mC und 5hmC mit einer Einzelbasenauflösung sowohl auf Whole-Genome- als auch auf Targeted-Region-Plattformen. oxBS-seq ist geeignet für Verbesserungs- und Zielmethoden, wie post-bisulfid-spezifische PCR und BS-seq mit reduzierter Repräsentation, zusätzlich zur Whole-Genome-Analyse.

Referenzen:

1. Kirschner K, Krueger F, Green AR, Chandra T. Multiplexing für oxidative Bisulfite-Sequenzierung (oxBS-seq). In DNA-Methylierungsprotokolle 2018. Humana Press.
2. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), oder wie man seine Lieblingszelle identifiziert. Epigenome2018, 2(1).
3. Booth MJ, Marsico G, Bachman M, u. a.Quantitative Sequenzierung von 5-Formylcytosin in DNA mit Einzelbasenauflösung. Naturwissenschaftliche Chemie. 2014, 6(5):435.
4. Booth MJ, Branco MR, Ficz G, u. a.Balasubramanian S. Quantitative Sequenzierung von 5-Methylcytosin und 5-Hydroxymethylcytosin mit Einzelbasenauflösung. Wissenschaft2012.
5. Schüler P, Miller AK. Sequenzierung der sechsten Base (5‐Hydroxymethylcytosin): Selektive DNA-Oxidation ermöglicht die Auflösung von Basenpaaren. Angewandte Chemie International Edition. 2012, 51(43).