Bisulfid-Sequenzierung: Einführung, Merkmale, Arbeitsablauf und Anwendungen

DNA-Methylierung

DNA-Methylierung, ein grundlegender biologischer Prozess, beinhaltet die Hinzufügung einer Methylgruppe zu spezifischen Basen innerhalb der DNA-Sequenz durch kovalente Bindung, die durch DNA-Methyltransferase (DNMT) vermittelt wird.

Diese chemische Modifikation ist eine entscheidende Form der epigenetischen Regulation, die die DNA-Sequenz bewahrt und gleichzeitig die Genaktivität beeinflusst. Sie hat tiefgreifende Auswirkungen auf verschiedene biologische Phänomene, einschließlich der Genexpression, der embryonalen Entwicklung, der Zellproliferation, der Differenzierung, der Aufrechterhaltung der Genomstabilität und der Abwehr gegen exogene DNA-Invasionen.

Die DNA-Methylierung erfolgt an verschiedenen Positionen der DNA-Basen, wie der C-5-Position von Cytosin, der N-6-Position von Adenin und der N-7-Position von Guanin, katalysiert durch verschiedene DNA-Methylierungsenzyme. Besonders die Methylierung des 5. Kohlenstoffatoms von Cytosin an CpG-Stellen (Cytosin-Phosphat-Guanin-Stellen) ist intensiv erforscht und führt zu 5-Methylcytosin (5-mC).

5-mCDas resultierende Produkt ist in den Genomen von Pflanzen, Tieren und anderen eukaryotischen Organismen allgegenwärtig und stellt eine der am intensivsten untersuchten Formen der DNA-Methylierungsmodifikation dar.

Verschiedene NGS-basierte DNA-Methylierungsanalysemethoden. (Jeong et al., 2016)

Was ist Bisulfit-Sequenzierung (BS-seq)?

Bisulfit-Sequenzierung, oft abgekürzt als BS-seq, ist eine leistungsstarke Methode zur Erkennung von DNA-Methylierungsmustern mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene. Durch die Behandlung von DNA mit Bisulfit werden unmethylierte Cytosine in Uracil umgewandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Diese unterschiedliche Umwandlung ermöglicht es Forschern, zwischen methylisierten und unmethylisierten Cytosinen bei der Analyse der DNA-Sequenz zu unterscheiden. Diese Technik ist entscheidend für das Verständnis der epigenetischen Regulation und ihrer Rolle in verschiedenen biologischen Prozessen, einschließlich Entwicklung, Krankheit und Genexpression.

Das Prinzip des gesamten Genoms BS-Sequenzierung beinhaltet die Behandlung von genomischer DNA mit Natriumbisulfid, das alle unmethylierten Cytosine in Uracil umwandelt, während methyliertes Cytosin unverändert bleibt. Nach der Bisulfidbehandlung werden Primer entworfen, um Regionen von Interesse, typischerweise CpG-Inseln, mittels PCR zu amplifizieren. Die resultierenden PCR-Produkte werden dann gereinigt und mithilfe von TA-Klonierung kloniert. Positive Klone werden ausgewählt und einer Sequenzierung unterzogen, um den Methylierungsstatus an jedem CpG-Stelle zu bestimmen. Schließlich werden die sequenzierten Daten mit der ursprünglichen genomischen Sequenz ausgerichtet, um die Anzahl und den Standort der methylierten Stellen sowie das allgemeine Methylierungsniveau zu analysieren.

Oxidative Bisulfit-Sequenzierung (OxBS-seq) und standardmäßige Bisulfit-Sequenzierung (BS-seq). (Rauch et al., 2023)

Der Workflow von BS-seq

• Qualitätstest von DNA-Proben

DNA-Proben unterliegen einer ersten Qualitätsbewertung, um die Eignung für die Sequenzierung sicherzustellen.

• Bibliotheksbau

Genomisches DNA wird durch Sonikation in Fragmente von 100-300 bp zerlegt.

DNA-Enden werden repariert, eine A-Base wird am 3'-Ende hinzugefügt und Sequenzierungsadapter werden ligiert.

Bisulfitbehandlung wird angewendet, um unmethylierte Cytosine in Uracil umzuwandeln.

Entsalzungs- und Gelreinigungsschritte werden durchgeführt, um geeignete Bibliotheksfragmentgrößen auszuwählen.

Die PCR-Amplifikation wird durchgeführt, um die Bibliotheksfragmente anzureichern, gefolgt von einer weiteren Runde der Größenauswahl.

Qualitätskontrollen werden an den erstellten Bibliotheken durchgeführt.

• Sequenzierung

Bibliotheken, die die Qualitätskontrolle bestehen, werden einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen.

• Datenanalyse

Die Sequenzierungsergebnisse sind an das Referenzgenom ausgerichtet.

Einzigartige Sequenzen werden für die anschließende Analyse extrahiert.

Die erste Datenfilterung wird durchgeführt, um qualitativ minderwertige Reads zu entfernen.

• Datenvalidierung

Die nutzbare Datenmenge wird bewertet, um die Einhaltung der Projektanforderungen sicherzustellen.

Der Vergleich der verfügbaren Daten mit dem Referenzgenom wird durchgeführt, was Vergleichsergebnisse liefert.

• Methylierungsanalyse

Qualitätsgeprüfte Vergleichsdaten werden verwendet, um genomweite Methylierungsinformationen abzuleiten.

Die Informationsanalyse und -verarbeitung werden durchgeführt, um standardisierte und personalisierte Analyseergebnisse zu erzeugen.

Ergebnisinterpretation: Methylierungsmuster und -variationen werden im Kontext der biologischen Bedeutung und möglicher Implikationen für die untersuchten Proben interpretiert.

Vorteile der BS-seq

• Bietet eine umfassende Abdeckung von CpG- und non-CpG-Methylierung im gesamten Genom mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene.
• Ermöglicht die Analyse von Methylierungsmustern in verschiedenen genomischen Regionen, einschließlich dichten, weniger dichten und repetitiven Sequenzen.

Herausforderungen der BS-seq

• Bisulfitbehandlung wandelt unmethyliertes Cytosin in Thymin um, wodurch die Sequenzkomplexität verringert wird und es schwierig wird, genaue Vergleiche zu erstellen.
• Potenzielle Vorkommen von Nukleotidpositionen (NPs), an denen die Umwandlung von Cytosin zu Thymin während der Bisulfitbehandlung unvollständig ist.
• Unfähigkeit, zwischen 5-Methylcytosin (5mC) und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu unterscheiden, was zu Unklarheiten bei der Bestimmung des Methylierungsstatus führt.

Mit dem Fortschritt der Technologie sind zahlreiche Variationen von Bisulfid-Sequenzierung (BS-seq) sind entstanden, jede mit ihren eigenen Vorteilen und Anwendungen.

• oxBS-seq (Oxidiertes Bisulfite-Sequencing): Wie bereits erwähnt, beinhaltet oxBS-seq die Oxidation von 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) zu 5-Formylcytosin (5fC) vor der Bisulfidbehandlung, was die präzise Erkennung von 5-Methylcytosin (5mC) ermöglicht.
• TAB-seq (Tet-assistierte Bisulfid-Sequenzierung): Diese Methode beinhaltet die Verwendung von Tet-Enzymen, um 5mC zu 5hmC oder weiter oxidierten Formen vor der Bisulfidbehandlung zu oxidieren, was die Unterscheidung zwischen verschiedenen Cytosinmodifikationen ermöglicht.
• CMS-seq (Chromatin-Methylierungs-Sequenzierung): CMS-seq kombiniert Bisulfit-Sequenzierung mit Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) und ermöglicht die gleichzeitige Analyse von DNA-Methylierung und Histonmodifikationen.
• BSPP-seq (Bisulfite Padlock Probes Sequenzierung): Diese Methode nutzt Padlock-Sonden, um Zielregionen von Interesse vor der Bisulfitbehandlung zu erfassen, was eine gezielte Bisulfitsequenzierung mit verbesserter Abdeckung und Sensitivität ermöglicht.
• BS-PCR (Bisulfit-Polymerase-Kettenreaktion): Diese Technik umfasst eine Bisulfitbehandlung, gefolgt von der PCR-Amplifikation spezifischer Zielregionen, die eine gezielte Analyse der DNA-Methylierung ermöglicht.
• BSAS (Bisulfid-Amplicon-Sequenzierung): Ähnlich wie BS-PCR beinhaltet BSAS die Bisulfidbehandlung und die PCR-Amplifikation spezifischer Zielregionen, nutzt jedoch typischerweise Next-Generation-Sequencing für die Hochdurchsatzanalyse.

Whole Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS)

Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung (WGBS) ist eine leistungsstarke Technik, die für die genomweite DNA-Methylierungsanalyse verwendet wird. Sie bietet eine Auflösung auf Einzelbasenebene der DNA-Methylierung über das gesamte Genom.

Bei WGBS wird genomische DNA mit Natriumbisulfid behandelt, das unmethylierte Cytosine in Uracil umwandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Nach der Bisulfidbehandlung wird hochdurchsatzfähige Next-Generation-Sequenzierung (NGS) verwendet, um die behandelten DNA-Fragmente zu sequenzieren. Durch den Vergleich der Sequenzierungsreads mit einem Referenzgenom können Forscher den Methylierungsstatus einzelner Cytosine im gesamten Genom bestimmen.

WGBS wurde in verschiedenen Arten, einschließlich Menschen, Pflanzen, Tieren und niederen Organismen, weit verbreitet eingesetzt, um genomweite DNA-Methylierungsmuster zu untersuchen. Es liefert wertvolle Einblicke in die Rolle der DNA-Methylierung bei der Genregulation, der Entwicklung, Krankheiten und der Evolution.

Whole Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS) – CD Genomics

Reduzierte Repräsentation Bisulfite-Sequenzierung (RRBS)

Reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (RRBS) ist ein Verfahren, das die Anreicherung von CCGG-reichen Fragmenten in genomischer DNA durch Restriktionsenzymverdau umfasst. Anschließend unterziehen sich diese angereicherten Fragmente, die typischerweise CpG-reiche Regionen des Genoms enthalten, einer Methylierungssequenzierung mit Einzelbasenauflösung durch Bisulfitbehandlung und Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie. Im Vergleich zur Whole Genome Bisulfite Sequencing (WGBS), RRBS ist ein kosteneffektiverer Ansatz, da er deutlich weniger Sequenzierungsvolumen erfordert und dennoch wertvolle Methylierungssequenzierungsdaten liefert. Dies macht RRBS besonders geeignet für großangelegte klinische Studien, die eine genomweite Methylierungsanalyse beinhalten.

In vereinfachten Begriffen wandelt die Bisulfitbehandlung unmethylierte Cytosine (C) in Uracil (U) um, die während der Sequenzierung dann als Thymin (T) gelesen werden. Durch den Vergleich der Anzahl der in Thymin umgewandelten Reads mit der Gesamtzahl der Reads, die eine spezifische Cytosin-Stelle abdecken, können Forscher die Methylierungsrate an dieser Stelle berechnen. Diese Technik ist von unschätzbarem Wert für das Studium verschiedener biologischer Prozesse wie embryonale Entwicklung, Alterungsmechanismen, Krankheitsentwicklung und die Identifizierung von krankheitsbezogenen epigenetischen Marker-Loci.

Reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung – CD Genomics

Oxidative Bisulfite-Sequenzierung (oxBS-seq)

Die Bedeutung der Hydroxymethylierung (5hmC) im Säugetiergenom und ihre Auswirkungen auf verschiedene biologische Prozesse wie Entwicklung, Alterung, neurodegenerative Erkrankungen und Tumorigenese. Hydroxymethylierung ist in der Tat eine relativ neue Entdeckung im Bereich der Epigenetik, und sie hat aufgrund ihrer aufkommenden Rollen und potenziellen Implikationen erhebliche Aufmerksamkeit erregt.

Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung der DNA-Hydroxymethylierung besteht darin, sie von der DNA-Methylierung (5mC) zu unterscheiden, insbesondere bei der Verwendung herkömmlicher Bisulfit-Sequenzierungsmethoden. Wie Sie erwähnt haben, wandelt die Bisulfit-Behandlung sowohl 5mC als auch 5hmC in ähnliche Produkte um, was es schwierig macht, zwischen den beiden Modifikationen zu unterscheiden.

Oxidative Bisulfite-SequenzierungoxBS-Seq) ist eine ausgeklügelte Technik, die diese Herausforderung angeht. Durch die chemische Oxidation von 5hmC zu einem anderen Zwischenprodukt vor der Bisulfidbehandlung ermöglicht oxBS-Seq die spezifische Detektion von 5mC, während die Effekte von 5hmC ausgeschlossen werden. Darüber hinaus kann oxBS-Seq mit anderen Sequenzierungsansätzen kombiniert werden, um sowohl DNA-Methylierung als auch Hydroxymethylierung mit einer Einzelbasenauflösung gleichzeitig zu detektieren.

Dieser Fortschritt in der Technologie hat unsere Fähigkeit, das komplexe Zusammenspiel zwischen DNA-Methylierung und Hydroxymethylierung sowie deren Rollen in verschiedenen biologischen Prozessen und Krankheiten zu analysieren, erheblich verbessert. oxBS-Seq birgt enormes Potenzial für das Verständnis der epigenetischen Regulation und ihrer Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und Krankheit.

BSAS (Bisulfit-Amplicon-Sequenzierung)

Bisulfit-Amplicon-Sequenzierung ist ein gezielter Ansatz zur Analyse von DNA-Methylierungs- oder Hydroxymethylierungsmustern in spezifischen genomischen Regionen von Interesse. So funktioniert die Technik typischerweise:

• Primer-Design: Methylierungsspezifische Amplifikationsprimer werden entwickelt, um spezifische DNA-Sequenzen im Genom anzusprechen. Diese Sequenzen entsprechen häufig Regionen von Interesse, wie Genen oder regulatorischen Elementen.
• Bisulfidbehandlung: Genomisches DNA wird mit Bisulfid behandelt, das unmethylierte Cytosine in Uracil (und anschließend in Thymin während der PCR) umwandelt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Im Falle der Analyse von Hydroxymethylierung kann ein zusätzlicher Oxidationsschritt eingeschlossen werden, um Hydroxymethylcytosin (5hmC) vor der Bisulfidbehandlung in ein anderes Zwischenprodukt umzuwandeln.
• PCR-Amplifikation: Die bisulfitiert DNA wird dann einer PCR-Amplifikation unterzogen, bei der die methylierungsspezifischen Primer verwendet werden. Dieser Amplifikationsschritt zielt selektiv auf die interessierenden Regionen ab, was zur Erzeugung von DNA-Fragmenten führt, die diesen Regionen entsprechen.
• Sequenzierung: Die amplifizierten DNA-Fragmente werden dann einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen, die Technologien der nächsten Generation wie die Illumina-Sequenzierung nutzt. Dies ermöglicht die genaue Erkennung des Methylierungs- oder Hydroxymethylierungsstatus der angestrebten Genregionen mit einer Auflösung auf Einzelbasenebene.

Durch die Fokussierung auf spezifische genomische Regionen von Interesse bietet die Bisulfid-Amplicon-Sequenzierung eine kostengünstige und effiziente Methode zur gezielten Analyse von DNA-Methylierung oder Hydroxymethylierung. Dieser Ansatz ist besonders nützlich, wenn der Methylierungsstatus spezifischer Gene oder regulatorischer Elemente, die mit bestimmten biologischen Prozessen oder Krankheiten assoziiert sind, untersucht wird.

Tet-unterstützte Bisulfit-Sequenzierung

TAPS-Sequenzierung, oder Tet-assistierte Bisulfid-Sequenzierung, ist eine innovative Methode zur Analyse von DNA-Methylierungsmustern, die mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Bisulfid-Sequenzierungstechniken bietet.

Bei der Tet-unterstützten Bisulfit-Sequenzierung wird die Bisulfit-Konversion durch einen anderen chemischen Ansatz ersetzt, der methyliertes Cytosin (5mC) direkt in Thymin (T) für die Sequenzierung umwandelt. Diese Technik nutzt eine Kombination aus enzymatischen und chemischen Reaktionen, um die Umwandlung von Cytosin in Thymin zu erreichen.

So funktioniert die Tet-unterstützte Bisulfit-Sequenzierung:

• Oxidation von 5mC und 5hmC: Zunächst werden 5mC und 5hmC mit dem TET1-Oxidase zu 5caC (5-Carboxycytosin) oxidiert.
• Umwandlung zu DHU: Das oxidierte 5caC wird dann in Gegenwart des Reduktionsmittels Pyridinboran (Pyridin) in Dihydrouracil (DHU) umgewandelt. DHU kann während der PCR-Amplifikation als Vorlage dienen.
• PCR-Amplifikation: Während der PCR-Amplifikation erkennt die DNA-Polymerase DHU als Uracil (U), was zur Einfügung von Adenin (A) gegenüber der DHU-Stelle führt. Infolgedessen werden Cytosine in der ursprünglichen DNA-Sequenz effektiv in Thymin in dem endgültigen PCR-Produkt umgewandelt.

Die Vorteile der TAPS-Technologie umfassen:

• Nicht destruktiv für DNA: Im Gegensatz zur Bisulfit-Konversion führt die Tet-unterstützte Bisulfit-Sequenzierung nicht zu einer Zersetzung der DNA, was zu einem geringeren DNA-Verlust während des Prozesses führt.
• Verbesserte Qualität der Sequenzierungsdaten: Tet-unterstützte Bisulfit-Sequenzierung bewahrt das Basenverhältnis der DNA-Sequenz, was zu hochwertigeren Sequenzierungsdaten mit erhöhter Abdeckung und Komplexität führt.
• Kosten-Effektivität: Tet-assistierte Bisulfit-Sequenzierungstechnologie ist im Allgemeinen kosteneffektiver als traditionelle Bisulfit-Umwandlungsmethoden.
• Zusätzlich ermöglicht die Tet-unterstützte Bisulfit-Sequenzierung die Beibehaltung längerer DNA-Fragmente (bis zu 10 kb), was vorteilhaft für nachgelagerte Anwendungen wie die Triple-Sequenzierung ist.

Insgesamt bietet die Tet-unterstützte Bisulfid-Sequenzierung eine vielversprechende Alternative zur Bisulfid-Sequenzierung für die DNA-Methylierungsanalyse, da sie eine verbesserte Datenqualität, reduzierte DNA-Verluste und Kosteneffizienz bietet.

OxBS-Seq, BS-Seq und TAB-Seq. (Schüler et al., 2012)

Nanoporen-Sequenzierung

Nanoporen-Sequenzierung ist eine revolutionäre Technologie, die die direkte, Echtzeit-Sequenzierung von DNA- und RNA-Molekülen ermöglicht.

• Nanopore-Detektion: Die Nanopore-Sequenzierung umfasst das Durchleiten eines DNA- oder RNA-Moleküls durch ein winziges biologisches oder festes Nanopore. Während das Molekül durch das Nanopore hindurchgeht, verursacht es Störungen im elektrischen Strom, der durch das Pore fließt. Diese Störungen sind charakteristisch für die spezifische Nukleotidsequenz des Moleküls.
• Signalerkennung: Die Störungen im elektrischen Strom werden vom Nanoporen-Sequenzierungsgerät als "Zickzacklinien" erkannt und aufgezeichnet. Jedes Nukleotid, das durch die Pore gelangt, erzeugt ein einzigartiges Zickzackmuster, das die Bestimmung der Sequenz ermöglicht.
• Methylierungsnachweis: Neben der Nukleotidsequenz kann die Nanoporen-Sequenzierung auch epigenetische Modifikationen wie die DNA-Methylierung nachweisen. Das Vorhandensein von methylierten Basen verändert die elektrischen Eigenschaften der Nukleotide, was zu einzigartigen Signalmustern führt, wenn sie die Nanopore passieren.
• Deep Learning Modelle: Deep Learning Algorithmen werden eingesetzt, um die komplexen Signal Muster zu analysieren, die durch Nanoporen-Sequenzierung erzeugt werden. Durch das Training dieser Modelle mit bekannten Methylierungsmustern können Forscher Werkzeuge entwickeln, die Methylierungsmodifikationen in DNA- und RNA-Molekülen basierend auf den Signalen der Nanoporen-Sequenzierung genau identifizieren und charakterisieren.

Insgesamt bietet die Nanoporen-Sequenzierung in Kombination mit Deep-Learning-Modellen einen leistungsstarken und vielseitigen Ansatz zur direkten Erkennung von DNA- und RNA-Sequenzen sowie epigenetischen Modifikationen wie der DNA-Methylierung. Diese Technologie hat vielfältige Anwendungen in der Genomik, Epigenetik und biomedizinischen Forschung.

Referenzen:

1. Rauch, Tibor A., und Gerd P. Pfeifer. "Methoden zur Analyse von DNA-Cytosin-Modifikationen im gesamten Genom." Handbuch der EpigenetikAkademischer Verlag, 2023. 123-135.
2. Schüler, Peter, und Aubry K. Miller. "Sequenzierung der sechsten Base (5-Hydroxymethylcytosin): Selektive DNA-Oxidation ermöglicht die Auflösung von Basenpaaren." Angewandte Chemie International Edition 51,43 (2012): 10704-10707.
3. Jeong H.M., et al. Effizienz der immunpräzipitierten Bisulfit-Sequenzierung von methylierter DNA zur Analyse der DNA-Methylierung im gesamten Genom. Epigenomics. 2016, 8(8):1061-77.