Whole-Genome Bisulfite-Sequenzierung (WGBS) Protokoll

Bisulfitbehandlung

1. Bereiten Sie das Reagenz vor, indem Sie 900 μL Wasser, 300 μL M-Dilutionspuffer und 50 μL M-Lösungsmittel hinzufügen. Lösen Sie das Pulver vollständig auf, indem Sie es bei Raumtemperatur mindestens 10 Minuten lang mischen. Bereiten Sie es vor der Verwendung vor.
Mischen Sie 130 μL des CT-Umwandlungsreagenz, 100 ng DNA und 1 ng unmethyliertes Lambda-DNA in einem PCR-Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen mit Wasser auf 150 μL ein.
3. Inkubieren Sie die Röhrchen 10 Minuten bei 98 °C und 150 Minuten bei 64 °C.
4. Laden Sie die Probe in die Zymo Spin-Säule mit 600 μL M-Binding-Puffer.
5. Mischen Sie die Probe und die M-Bindungs-Puffer, indem Sie die Zymo Spin-Säule umdrehen.
6. Zentrifugieren Sie bei 10.000 ×g für 1 Minute und entsorgen Sie die Durchlaufflüssigkeit.
Fügen Sie 200 μL M-Desulfonierungs-Puffer zur klaren Säule hinzu und inkubieren Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Übertragen Sie die Säule in ein neues Röhrchen.
Fügen Sie 20–40 μL M-Elutionspülflüssigkeit direkt zur Säule hinzu.
Zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei voller Geschwindigkeit, um die DNA zu eluieren.
Verwenden Sie 1 μL Eluent, um die Menge an DNA zu messen.

Zufällige Priming

1. Mischen Sie die bisulfitiert behandelte DNA, 5 μL 10× NEBuffer 2, 4 μL dNTP-Lösung und 1 μL 100 μM PEA2 N4 in einem PCR-Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen mit Wasser auf 50 μL ein.
2. Inkubieren Sie bei 95 °C für 3 Minuten und bei 4 °C für 5 Minuten.
3. Fügen Sie 1 μL des Klenow-Fragments (3'–5' exo-) zur Reaktion hinzu.
4. Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 4 °C und erhöhen Sie die Temperatur mit einer Rate von +1 °C/min auf 37 °C. Nach 30 Minuten bei 37 °C die Reaktion aufrechterhalten, inaktivieren Sie das Enzym durch Erhitzen auf 70 °C für 10 Minuten.
5. Fügen Sie 50 μL AMPure XP zur Reaktion hinzu, lassen Sie das Röhrchen 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, platzieren Sie das Röhrchen auf einem Magnetständer, um die Perlen zu sammeln, und entfernen Sie den Überstand.
6. Fügen Sie 200 μL der 300 bp Cutoff-Lösung hinzu, resuspendieren Sie die Perlen, stellen Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer und entfernen Sie die Überstände.
7. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal.
8. Nach dem Spülen der Perlen mit 200 μL 70% (v/v) Ethanol, eluieren Sie die DNA mit 12 μL 10 mM Tris–HCl, pH 8,5.
9. Messen Sie die DNA-Menge.

TACS-Ligation

Mischen Sie 10 μL des 2,5× TACS-Reaktionspuffers, 11 μL der im vorherigen Schritt gereinigten DNA, 1 μL von 30 μM PA-anti-PEA1 P und 1 μL von 10 mM ATP in einem PCR-Röhrchen.
2. Inkubieren Sie bei 95 °C für 5 Minuten und bei 4 °C für 5 Minuten.
Fügen Sie 1 μL von 15 U/μL TdT und 1 μL von 100 U/μL CircLigase II zur Reaktion hinzu.
4. Inkubieren Sie bei 37°C für 30 Minuten, bei 65°C für 120 Minuten und bei 95°C für 5 Minuten.

Primerverlängerung (1)

1. Fügen Sie nach der TACS-Ligation 5 μL 10× Gene Taq Universalpuffer, 4 μL 2,5 mM dNTPs, 1 μL Indexierungsprimer, 1 μL 2,5 U/μL Hot Start GeneTaq und 14 μL Wasser zur Reaktion hinzu.
2. Inkubieren bei 95°C für 3 Minuten, 45°C für 3 Minuten und 72°C für 30 Minuten.
3. Fügen Sie 20 μL Puffer B2 und 5 μL 20 mg/mL Proteinase K zur Reaktion hinzu.
4. Inkubieren Sie bei 50 °C für 15 Minuten.
Fügen Sie 50 μL AMPure XP hinzu und inkubieren Sie dann 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Sammeln Sie die Perlen und entfernen Sie die Überstände.
7. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL Trennlösung.
8. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt einmal.
9. Spülen Sie die Perlen mit 200 μL 70% (v/v) Ethanol.
10. Entfernen Sie die verbleibende Lösung vollständig.
Fügen Sie 40 μL 10 mM Tris-Acetat hinzu, um die Perlen wieder in Lösung zu bringen, stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer, um die Perlen zu trennen, und übertragen Sie den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen.
12. Messen Sie die DNA-Konzentration.

Primerverlängerung (2)

Fügen Sie 5 μL von 10× GeneTaq Universal Buffer, 4 μL von 2,5 mM dNTPs, 1 μL von 60 μM Primer-3 und 1 μL von 5 U/μL Hot Start GeneTaq zu 39 μL der im vorherigen Schritt gereinigten DNA hinzu.
2. Inkubieren bei 94°C für 3 Minuten, 45°C für 5 Minuten und 72°C für 30 Minuten.
3. Fügen Sie 50 μL AMPure XP hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
4. Sammeln Sie die Perlen, indem Sie das Röhrchen auf einen Magnetständer stellen.
5. Waschen Sie die Perlen mit 200 μL Cutoff-Lösung.
Wiederholen Sie den Schritt einmal.
7. Spülen Sie die Perlen mit 200 μL 70% (v/v) Ethanol.
8. Entfernen Sie die verbleibende Lösung vollständig.
9. Fügen Sie 26 μL 10 mM Tris-Acetat hinzu, um die Perlen wieder in Lösung zu bringen, stellen Sie das Röhrchen auf den Magnetständer, um die Perlen zu trennen, und übertragen Sie den Überstand in ein neues PCR-Röhrchen.
Nehmen Sie 1 μL der gereinigten DNA, um die Konzentration zu messen.

Bibliotheks-QC

1. Tauchen Sie den Inhalt des Library Quantitation Kits bei Raumtemperatur auf.
2. Bereiten Sie eine Mastermix-Lösung vor, indem Sie 10 μL/Well von Terra PCR Direct TB Green Premix (2×), 4 μL/Well von 5× Primer Mix, 0,4 μL/Well von 50× ROX Referenzfarbstoff und 3,6 μL/Well Wasser mischen, um eine Mastermix-Lösung herzustellen. Multiplizieren Sie das Volumen jedes Reagenz mit der Anzahl der Wells.
Dispensieren Sie 18 μL des Mastermixes in jedes PCR-Röhrchen.
5. Verdünnen Sie die Bibliotheken mit 10 mM Tris–HCl (pH 0,0) bei geeigneten Verdünnungsraten.
6. Fügen Sie entweder 2 μL der Vorlagen, d.h. Standard, nicht-template Kontrolle oder verdünnte Bibliotheken, zu einem PCR-Röhrchen mit dem Mastermix hinzu.
7. Bereiten Sie die Real-Time-PCR-Maschine vor.
8. Führen Sie die PCR-Amplifikation mit folgendem Programm durch: 95 °C für 1 Minute; 35 Zyklen mit dreistufigen Inkubationen bei 95 °C für 10 Sekunden, 60 °C für 15 Sekunden und 68 °C für 45 Sekunden.
9. Bereiten Sie ein Elektrophoresegerät vor.
Mischen Sie 1 μL amplifiziertes PCR-DNA mit 10 μL Denaturierungs-Ladefarbstoff, inkubieren Sie bei 70 °C für 5 Minuten und laden Sie 5 μL der Probe auf ein 6% Novex TBE-Urea-Gel.
11. Führen Sie die Elektrophorese bei 300 V durch.
Färben Sie das Gel mit SYBR Gold Nukleinsäure-Gel-Färbemittel und machen Sie ein Foto.

Sequenzierung

1. Mischen Sie die Bibliotheken entsprechend.
2. Passen Sie die Konzentration an.
3. Sequenzierer ausführen.

Referenz:

1. Miura F, Ito T. Post-Bisulfite-Adapter-Tagging mit einer hoch effizienten Einzelstrang-DNA-Ligationstechnik[M]//Transkriptionsfaktor-Regulationsnetzwerke. Humana, New York, NY, 2023: 45-57.