Richtlinien zur Einreichung von Proben
Übersicht über die Methylierte DNA Immunpräzipitation Sequenzierung (MeDIP-seq)
Was ist MeDIP-Seq?
DNA-Methylierung ist ein epigenetisch Marker, der eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen spielt, wie z.B. der embryonalen Entwicklung, der Genregulation und der Entstehung von Krankheiten. Der 5-Methylcytosin (5mC) ist eine häufige methyliert Form der DNA-Basen Cytosin. Die Kombination verschiedener Vorbehandlungsverfahren gefolgt von unterschiedlichen nachfolgenden molekularbiologischen Techniken, wie DNA-Mikroarrays und Next-Generation-Sequenzierung (NGS), macht die DNA-Methylierungsanalyse im gesamten Genom möglich. Verschiedene auf NGS basierende Technologien zur Erkennung von DNA-Methylierung sind in Tabelle 1 zusammengefasst (Su, 2012).
Tabelle 1. NGS-basierte Technologien zur Erkennung von DNA-Methylierung.
| Vorbehandlungsverfahren | NGS-basierte Analyse | Anwendungen |
| Endonukleaseverdauung | Methl-seq | Untersuchen Sie eine Reihe von genomischen Elementen; Ermöglichen Sie eine umfassendere Untersuchung von Regionen als klassische Methylierungsstudien, die auf CpG-Inseln und Promotoren beschränkt sind. |
| HELP-seq | Messen Sie sich wiederholende Sequenzen, Kopienzahlvariabilität, allelspezifische und kleinere Fragmente (<50 bp); Erkennen Sie die hypomethylierten Loci empfindlich. | |
| MSCC | Identifizieren Sie unmethylierte Regionen, indem Sie unmethylierte CpGs mit einer Auflösung von einzelnen Basenpaaren lokalisieren. | |
| Affinity-Anreicherung | MeDIP-seq | Generieren Sie unverzerrte, kosteneffektive und vollständige Genom-Methylierungsniveaus ohne die Einschränkungen von Restriktionsstellen oder CpG-Inseln; |
| MIRA-seq | Analysiere wiederhergestellte oder doppelsträngige methyliertes DNA auf genomweiter Ebene; Sei anwendbar auf verschiedene klinische und diagnostische Situationen. | |
| MDB-Sequenz | In biologischen Kontexten angewendet werden, um differentially methylierte Regionen im genomischen Maßstab zu identifizieren. | |
| MethylCap-seq | Erkennen von unterschiedlich methylierten Regionen mit hoher Genomabdeckung; Erkennen von DMRs in klinischen Proben | |
| Bisulfite-Konversion | WGBS | Sensitiv messen von Cytosin-Methylierung auf genomweiter Ebene |
| RRBS | Analysiere eine begrenzte Anzahl von Genpromotoren und regulatorischen Sequenzelementen in einer großen Anzahl von Proben; Analysiere und vergleiche genomische Methylierungsmuster. | |
| BSPP | Konzentrieren Sie sich auf die Sequenzierung der informativsten genomischen Regionen; Anwenden auf Exon-Erfassung und SNP-Genotypisierung; Methylierung in großen Genomen erkennen | |
| BC-Sequenz | Erkennen von standortspezifischen Schaltern in der Methylierung; Bestimmen der DNA-Methylierungsfrequenzen in CGIs, die aus verschiedenen genomischen Kontexten, einschließlich Promotoren, Exonen, Introns und intergenen Loci, entnommen wurden. |
Methyliertes DNA-Immunpräzipitation (MeDIP), das erstmals 2005 beschrieben wurde (Weber et al., 2005), ist eine genomweite Reinigungstechnik, die verwendet wird, um methylierten DNA-Fragmente mit spezifischen Antikörpern anzureichern. MeDIP-Sequenzierung (MeDIP-Seq) erstmals 2008 beschrieben, ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung 5mC und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) Modifikation durch Kombination von MeDIP mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (Down et al., 2008). Die Tiefensequenzierung könnte eine große Genomabdeckung bieten und die Mehrheit der immunopräzipitierten methylierten DNA aufdecken.
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Wie funktioniert MeDIP-Seq?
Der Arbeitsablauf von MeDIP-seq wird in Abbildung 1 veranschaulicht. Es beginnt mit der Isolierung von methylierten DNA-Fragmenten durch 5mC-spezifische Antikörper durch Immunpräzipitation. Anschließend wird die angereicherte methyliert DNA einer DNA-Reinigung, Bibliotheksvorbereitung und Hochdurchsatz-Sequenzierung (Taiwo et al., 2012).
Abbildung 1. Workflow von MeDIP-seq.
Was sind die Vorteile von MeDIP-seq?
- Cover CpG und non-CpG 5mC im gesamten Genom.
- Sei auf genomweiter Ebene oder in beliebigen Interessensgebieten.
- Vermeiden Sie unspezifische Anreicherung von 5hmC, indem Sie während des MeDIP-Prozesses einen 5mC-spezifischen Antikörper verwenden.
- Benötigen Sie eine geringe Menge DNA.
Was sind die Einschränkungen von MeDIP-seq?
- Genomische Auflösung: Die Auflösung des Methyloms ist geringer (~150 bp) im Vergleich zur Einzelbasenauflösung, die durch Bisulfit-Sequenzierung angeboten wird.
- Unspezifische Interaktion: Die Spezifität und Selektivität von Antikörpern müssen getestet werden, um unspezifische Interaktionen zu vermeiden.
- Antikörperbasierte Selektionsverzerrung: Die Rückgewinnung von methyliertem DNA durch den Antikörper wird von der Dichte von mC/mCG beeinflusst, was dazu führt, dass Regionen mit sehr niedriger (<1,5%) Dichte möglicherweise unterrepräsentiert oder sogar als unmethyliert interpretiert werden (Taiwo et al., 2012). Die antikörperbasierte Selektion ist auf hypermethylierten Regionen verzerrt.
Wie werden MeDIP-Seq-Daten analysiert?
Ein häufig verwendeter Bioinformatik-Workflow zur Analyse von MeDIP-seq Die Daten sind in Abbildung 2 dargestellt.
Abbildung 2. Bioinformatik-Pipeline zur Analyse von MeDIP-seq-Daten.
Eine Reihe von computergestützten Werkzeugen wurde zur Analyse von MeDIP-Daten entwickelt, darunter Batman, MEDIPS, MeDUSA und MeQA (Tabelle 2). Die zu verwendende Methode hängt weitgehend vom Zweck des Experiments ab.
Tabelle 2. Beispiele für Software zur Analyse von MeDIP-seq-Daten
| Software | Zusammenfassung |
| Batman | Bayesiansches Werkzeug zur Methylierungsanalyse von MeDIP-Profilen |
| MEDIPS | Bioconductor-Paket, das einen umfassenden Ansatz zur Normalisierung und Analyse von MeDIP-seq-Daten bietet. |
| MeDUSA | Führen Sie eine vollständige Analyse von MeDIP-seq Daten, einschließlich Sequenzalignment, Qualitätskontrolle und Bestimmung sowie Annotation von DMRs |
| MeQA | Pipeline für die Vorverarbeitung, Qualitätsbewertung, Leseverteilung und Methylierungsabschätzung von MeDIP-seq-Datensätzen |
Was sind die Unterschiede zwischen Medip-Chip und Medip-Seq?
Die gereinigte methyliert DNA über MeDIP kann in hochdurchsatzfähige DNA-Nachweismethoden wie hochauflösende DNA-Mikroarrays (MeDIP-Chip) oder Hochdurchsatz-Sequenzierung (MeDIP-SeqDer Workflow-Überblick von MeDIP-Chip und MeDIP-Seq ist in Abbildung 3 dargestellt. Bei MeDIP-Chip werden ein Teil der Eingangs-DNA und die angereicherte methylierten DNA mit Cyanin-5 (Cy5; rot) und Cyanin-3 (Cy3; grün) markiert, um Sequenzen zu identifizieren, die signifikante Unterschiede auf Hybridisierungsniveau aufweisen, wodurch bestätigt wird, dass die interessierende Sequenz angereichert ist.
Abbildung 3. Übersicht des Workflows des MeDIP-Verfahrens, gefolgt von (A) Array-Hybridisierung oder (B) Hochdurchsatz-Sequenzierung.
Verschiedene Ansätze zur Analyse der DNA-Methylierung haben konkurrierende Stärken und Schwächen. Die array-basierte Identifizierung von MeDIP-Sequenzen ist auf das Design des Arrays beschränkt. Infolgedessen ist die Auflösung auf die Sonden im Array-Design beschränkt, während die sequenzbasierte Identifizierung von MeDIP-Sequenzen im Allgemeinen auf jede Art anwendbar ist, für die ein Referenzgenom existiert. Eine Zusammenfassung der Merkmale und potenzieller Bias-Quellen für verschiedene Techniken ist in Tabelle 3 dargestellt (Laird, 2010).
Tabelle 3. Merkmale und Quellen von Verzerrungen für verschiedene Techniken
| MeDIP-Chip | MeDIP–seq | RRBS | WGBS | ||
| Funktionen | Eindeutige Identifizierung von gemessenen CpG. | √ | √ | ||
| In cis Co-Methylierung Informationen | √ | √ | |||
| Nicht-CpG-Methylierungsinformationen | √ | √ | |||
| Allelspezifische Messfähigkeit | √ | √ | √ | ||
| Gute Abdeckung von Regionen mit niedriger CpG-Dichte | √ | ||||
| Kompatibel mit geringen Mengen an Eingangs-DNA | √ | √ | |||
| Vollständige repeat-maskierte Genomabdeckung | √ | √ | √ | ||
| Potenzielle Quellen von Verzerrung | Kopienzahlvariationsbias | √ | √ | ||
| Fragmentgrößenverzerrung | |||||
| Unvollständige Bisulfit-Konversionsverzerrung | √ | √ | |||
| Bisulfit-PCR-Bias | √ | √ | |||
| Kreuzhybridisierungsbias | √ | ||||
| DNA-Methylierungsstatus-Bias | |||||
| GC-Gehalt-Bias | √ | √ | |||
| CpG-Dichte-Bias | √ | √ |
RRBS: Reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung
WGBS: Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung
Was sind die Anwendungen von MeDIP-Seq?
Die Vorteile von kosteneffektiven und der Bedarf an DNA mit niedrigem Input (Taiwo et al., 2012; Zhao et al., 2014) machen MeDIP-seq geeignet für Studien mit einer geringen Menge an DNA-Proben, wie Oocyten, frühen Embryonen (Zhang et al., 2017) und menschlichen Tumorbiopsien (Kim et al., 2011; Zhao et al., 2014).
Analyse von DNA-Methylierungsmustern: MeDIP-seq kann eingesetzt werden, um DNA-Methylierungsmuster im Genom zu analysieren, einschließlich globaler Muster und spezifischer Genregionen. Durch die Beobachtung des Methylierungsspektrums über verschiedene Proben hinweg können Veränderungen in der Methylierung identifiziert und quantifiziert werden, wodurch die regulatorischen Mechanismen der DNA-Methylierung in unterschiedlichen biologischen Kontexten aufgedeckt werden.
Identifizierung von MethylierungszielgenenMeDIP-seq kann effektiv eingesetzt werden, um Methylierungsgene zu identifizieren, die mit spezifischen biologischen Prozessen oder Krankheiten assoziiert sind. Durch die Untersuchung der Beziehung zwischen Methylierungsniveaus und Genexpression können potenzielle Zielgene, die durch Methylierung reguliert werden, ermittelt werden. Dies ermöglicht wiederum eine eingehende Untersuchung ihrer Funktionalität und Kontrollmechanismen in biologischen Phänomenen.
Diagnose und Behandlung von Krankheiten: MeDIP-seq Technologie spielt eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung des Beitrags der DNA-Methylierung zur Entstehung und Progression von Krankheiten und legt damit eine Grundlage für diagnostische Verfahren, Behandlungspläne und Präventionsmaßnahmen. Die vergleichende Analyse von Methylierungsmustern in gesunden und erkrankten Geweben kann die Identifizierung von assoziierten Methylierungsmarkern erleichtern und Einblicke in eine Vielzahl von Krankheiten bieten. Dies kann den Weg für bahnbrechende therapeutische Ansätze im Bereich der personalisierten Medizin ebnen.
Regulierung der Methylierung in Entwicklung und DifferenzierungMeDIP-seq kann entscheidend sein für die Erforschung dynamischer Veränderungen der DNA-Methylierung während der Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse und somit Licht auf die Funktion der Methylierung werfen, die das zelluläre Schicksal bestimmt und die Gewebeentwicklung beeinflusst. Durch die genaue Untersuchung von Methylierungsmustern in verschiedenen Entwicklungsstadien oder innerhalb spezifischer Zelltypen ist es möglich, wesentliche Methylierungsereignisse zu identifizieren und somit unser Verständnis der Mechanismen, die Entwicklung und Differenzierung steuern, zu vertiefen.
Wechselspiel von Umweltfaktoren und Methylierung: MeDIP-seq steht als ein mächtiges Werkzeug in der Untersuchung der Auswirkungen von Umwelteinflüssen auf die DNA-Methylierung und beim Entschlüsseln der komplexen Beziehung zwischen der Umwelt und der epigenetischen Regulation. Vergleiche, die aus den Methylierungsplänen von Proben gezogen werden, die unterschiedlichen Umwelteinflüssen ausgesetzt waren, ermöglichen eine klare Beobachtung der induzierten Methylierungsmodifikationen. Dies liefert entscheidende Einblicke für zukünftige Forschungen zu ihrer Relevanz in der Umweltanpassung und genetischen Variabilität.
Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige Epigenomik-Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich gezielte Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfid-Sequenzierung (RRBS), Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, MeDIP-Sequenzierungund ChIP-seq.
Referenzen:
- Down, T.A., Rakyan, V.K., Turner, D.J., Flicek, P., Li, H., Kulesha, E., Graf, S., Johnson, N., Herrero, J., Tomazou, E.M., et al. (2008). Eine bayesianische Dekonvolutionsstrategie für die Analyse des DNA-Methyloms basierend auf Immunpräzipitation. Naturbiotechnologie 26, 779-785.
- Kim, J.H., Dhanasekaran, S.M., Prensner, J.R., Cao, X., Robinson, D., Kalyana-Sundaram, S., Huang, C., Shankar, S., Jing, X., Iyer, M. u.a. (2011). Tiefensequenzierung zeigt unterschiedliche Muster der DNA-Methylierung bei Prostatakrebs. Genomforschung 21, 1028-1041.
- Laird, P.W. (2010). Prinzipien und Herausforderungen der genomweiten DNA-Methylierungsanalyse. Nature Reviews Genetics 11, 191-203.
- Su, J. (2012). Fortschritte bei Bioinformatik-Tools für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten der DNA-Methylierung. Erblichkeitsgenetik 01.
- Taiwo, O., Wilson, G.A., Morris, T., Seisenberger, S., Reik, W., Pearce, D., Beck, S., und Butcher, L.M. (2012). Methylom-Analyse mittels MeDIP-seq bei niedrigen DNA-Konzentrationen. Naturprotokolle 7, 617-636.
- Weber, M., Davies, J.J., Wittig, D., Oakeley, E.J., Haase, M., Lam, W.L., und Schubeler, D. (2005). Chromosomenweite und promoter-spezifische Analysen identifizieren Stellen der differentiellen DNA-Methylierung in normalen und transformierten menschlichen Zellen. Naturgenetik 37, 853-862.
- Zhang, Y., Gou, W., Ma, J., Zhang, H., Zhang, Y. und Zhang, H. (2017). Genom-Methylierung und regulatorische Funktionen für die hypoxische Anpassung bei tibetischen Hühnereiern. PeerJ 5, e3891.
- Zhao, M.T., Whyte, J.J., Hopkins, G.M., Kirk, M.D. und Prather, R.S. (2014). Methylierte DNA-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (MeDIP-seq) unter Verwendung geringer Mengen genomischer DNA. Zelluläre Reprogrammierung 16, 175-184.
