Übersicht über die Methyliertes DNA-Immunpräzipitations-Sequenzierung (MeDIP-seq)

Was ist MeDIP-Seq?

DNA-Methylierung ist ein epigenetisch Mark, der eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen spielt, wie z.B. der embryonalen Entwicklung, der Genregulation und der Entstehung von Krankheiten. Der 5-Methylcytosin (5mC) ist eine häufige methyliert Form der DNA-Basen Cytosin. Die Kombination verschiedener Vorbehandlungsverfahren, gefolgt von unterschiedlichen molekularbiologischen Techniken, wie DNA-Mikroarrays und Next-Generation-Sequenzierung (NGS)macht die DNA-Methylierungsanalyse im gesamten Genom möglich. Verschiedene auf NGS basierende Technologien zur Erkennung von DNA-Methylierung sind in Tabelle 1 zusammengefasst (Su, 2012).

Tabelle 1. NGS-basierte Technologien zur Erkennung von DNA-Methylierung.

Methylierte DNA-Immunpräzipitation (MeDIP), das erstmals 2005 beschrieben wurde (Weber et al., 2005), ist eine genomweite Reinigungstechnik, die verwendet wird, um methyliertes DNA-Fragmente mit spezifischen Antikörpern anzureichern. MeDIP-Sequenzierung (MeDIP-Seq) erstmals 2008 beschrieben, ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Untersuchung 5mC und 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) Änderung durch Kombination von MeDIP mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (Down et al., 2008). Die Tiefensequenzierung könnte eine umfassende Genomabdeckung bieten und die Mehrheit der immunopräzipitierten methylierte DNA enthüllen.

Wie funktioniert MeDIP-Seq?

Der Arbeitsablauf von MeDIP-seq ist in Abbildung 1 dargestellt. Es beginnt mit der Isolierung von methylierten DNA-Fragmenten durch 5mC-spezifische Antikörper über Immunpräzipitation. Anschließend wird die angereicherte methyliert DNA einer DNA-Reinigung, Bibliotheksvorbereitung und Hochdurchsatz-Sequenzierung (Taiwo et al., 2012).

Abbildung 1. Workflow von MeDIP-seq.

Was sind die Vorteile von MeDIP-seq?

• Cover CpG und non-CpG 5mC im gesamten Genom.
• Seien Sie auf genomweiter Ebene oder in beliebigen Interessengebieten.
• Vermeiden Sie unspezifische Anreicherung für 5hmC, indem Sie während des MeDIP-Prozesses einen 5mC-spezifischen Antikörper verwenden.
• Benötigen Sie DNA mit niedrigem Input.

Was sind die Einschränkungen von MeDIP-seq?

• Genomische Auflösung: Die Auflösung des Methyloms ist niedriger (~150 bp) im Vergleich zur Einzelbasenauflösung, die durch Bisulfid-Sequenzierung angeboten wird.
• Unspezifische Interaktion: Die Spezifität und Selektivität von Antikörpern müssen getestet werden, um unspezifische Interaktionen zu vermeiden.
• Antikörperbasierte Selektionsverzerrung: Die Wiedergewinnung von methyliertem DNA durch den Antikörper wird von der mC/mCG-Dichte beeinflusst, sodass Regionen mit sehr niedriger (<1,5%) Dichte unterrepräsentiert oder sogar als unmethyliert interpretiert werden können (Taiwo et al., 2012). Die antikörperbasierte Selektion ist auf hypermethylierten Regionen verzerrt.

Wie werden MeDIP-Seq-Daten analysiert?

Ein häufig verwendeter Bioinformatik-Workflow zur Analyse von MeDIP-seq Die Daten sind in Abbildung 2 dargestellt.

Abbildung 2. Bioinformatik-Pipeline zur Analyse von MeDIP-seq-Daten.

Eine Reihe von computergestützten Werkzeugen wurde zur Analyse von MeDIP-Daten entwickelt, darunter Batman, MEDIPS, MeDUSA und MeQA (Tabelle 2). Die zu verwendende Methode hängt weitgehend vom Zweck des Experiments ab.

Tabelle 2. Beispiele für Software zur Analyse von MeDIP-seq-Daten

Was sind die Unterschiede zwischen Medip-Chip und Medip-Seq?

Die gereinigte methyliertes DNA über MeDIP kann in hochdurchsatzfähige DNA-Nachweismethoden wie hochauflösende DNA-Mikroarrays (MeDIP-Chip) eingegeben werden oder Hochdurchsatzsequenzierung (MeDIP-SeqDer Workflow-Überblick von MeDIP-Chip und MeDIP-Seq ist in Abbildung 3 dargestellt. Bei MeDIP-Chip werden ein Teil der Eingangs-DNA und die angereicherte methyliert DNA mit Cyanin-5 (Cy5; rot) bzw. Cyanin-3 (Cy3; grün) markiert, um Sequenzen zu identifizieren, die signifikante Unterschiede auf Hybridisierungsniveau zeigen, wodurch bestätigt wird, dass die interessierende Sequenz angereichert ist.

Abbildung 3. Überblick über den Workflow des MeDIP-Verfahrens, gefolgt von (A) Array-Hybridisierung oder (B) Hochdurchsatz-Sequenzierung.

Verschiedene Ansätze zur Analyse der DNA-Methylierung haben unterschiedliche Stärken und Schwächen. Die array-basierte Identifizierung von MeDIP-Sequenzen ist auf das Design des Arrays beschränkt. Infolgedessen ist die Auflösung auf die Sonden im Array-Design beschränkt, während die sequenzbasierte Identifizierung von MeDIP-Sequenzen im Allgemeinen auf jede Art anwendbar ist, für die ein Referenzgenom existiert. Eine Zusammenfassung der Merkmale und potenziellen Bias-Quellen für verschiedene Techniken ist in Tabelle 3 dargestellt (Laird, 2010).

Tabelle 3. Merkmale und Quellen von Verzerrungen für verschiedene Techniken

RRBS: Reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung
WGBS: Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung

Was sind die Anwendungen von MeDIP-Seq?

Die Vorteile von kosteneffizientem und niedrigem Input-DNA (Taiwo et al., 2012; Zhao et al., 2014) machen MeDIP-seq geeignet für Studien, die eine geringe Menge an DNA-Proben erfordern, wie z. B. Oozyten, frühe Embryonen (Zhang et al., 2017) und menschliche Tumorbiopsien (Kim et al., 2011; Zhao et al., 2014).

Analyse von DNA-Methylierungsmustern: MeDIP-seq kann eingesetzt werden, um DNA-Methylierungsmuster im Genom zu analysieren, einschließlich globaler Muster und spezifischer Genregionen. Durch die Beobachtung des Methylierungsspektrums über verschiedene Proben hinweg können Veränderungen in der Methylierung identifiziert und quantifiziert werden, wodurch die regulatorischen Mechanismen der DNA-Methylierung in unterschiedlichen biologischen Kontexten aufgedeckt werden.

Identifizierung von MethylierungszielgenenMeDIP-seq kann effektiv eingesetzt werden, um Methylierungsgene zu identifizieren, die mit spezifischen biologischen Prozessen oder Krankheiten assoziiert sind. Durch die Untersuchung der Beziehung zwischen Methylierungsniveaus und Genexpression können potenzielle Zielgene, die durch Methylierung reguliert werden, ermittelt werden. Dies ermöglicht wiederum eine eingehende Untersuchung ihrer Funktionalität und Kontrollmechanismen in biologischen Phänomenen.

Diagnose und Behandlung von Krankheiten: MeDIP-seq Technologie spielt eine entscheidende Rolle bei der Untersuchung des Beitrags der DNA-Methylierung zur Entstehung und Progression von Krankheiten und legt damit eine Grundlage für diagnostische Verfahren, Behandlungspläne und präventive Maßnahmen. Die vergleichende Analyse von Methylierungsmustern in gesunden und erkrankten Geweben kann die Identifizierung von assoziierten Methylierungsmarkern erleichtern und Einblicke in eine Vielzahl von Krankheiten bieten. Dies kann den Weg für bahnbrechende therapeutische Ansätze im Bereich der personalisierten Medizin ebnen.

Regulierung der Methylierung in der Entwicklung und DifferenzierungMeDIP-seq kann entscheidend sein für die Erforschung dynamischer Veränderungen in der DNA-Methylierung während der Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse und somit Licht auf die Funktion der Methylierung werfen, die das zelluläre Schicksal bestimmt und die Gewebeentwicklung beeinflusst. Durch die genaue Untersuchung von Methylierungsmustern in verschiedenen Entwicklungsstadien oder innerhalb spezifischer Zelltypen ist es möglich, wesentliche Methylierungsereignisse zu identifizieren und somit unser Verständnis der Mechanismen, die Entwicklung und Differenzierung steuern, zu vertiefen.

Wechselspiel von Umweltfaktoren und Methylierung: MeDIP-seq steht als ein leistungsfähiges Werkzeug in der Untersuchung der Auswirkungen von Umwelteinflüssen auf die DNA-Methylierung und in der Entschlüsselung der komplexen Beziehung zwischen Umwelt und epigenetischer Regulation. Vergleiche, die aus den Methylierungsplänen von Proben gezogen werden, die unterschiedlichen Umwelteinflüssen ausgesetzt waren, ermöglichen eine klare Beobachtung induzierter Methylierungsmodifikationen. Dies liefert entscheidende Einblicke für zukünftige Forschungen zu ihrer Relevanz in der Umweltanpassung und genetischen Variabilität.

Bei CD Genomics sind wir bestrebt, zuverlässige Epigenomik-Sequenzierung Dienstleistungen, einschließlich gezielte Bisulfid-Sequenzierung, reduzierte Repräsentation Bisulfit-Sequenzierung (RRBS), Whole-Genome-Bisulfid-Sequenzierung, MeDIP-Sequenzierungund ChIP-seq.

Referenzen:

1. Down, T.A., Rakyan, V.K., Turner, D.J., Flicek, P., Li, H., Kulesha, E., Graf, S., Johnson, N., Herrero, J., Tomazou, E.M., et al. (2008). Eine Bayesian-Deconvolutionsstrategie für die Analyse des DNA-Methyloms basierend auf Immunpräzipitation. Naturbiotechnologie 26, 779-785.
2. Kim, J.H., Dhanasekaran, S.M., Prensner, J.R., Cao, X., Robinson, D., Kalyana-Sundaram, S., Huang, C., Shankar, S., Jing, X., Iyer, M. u.a. (2011). Tiefensequenzierung zeigt unterschiedliche Muster der DNA-Methylierung bei Prostatakrebs. Genomforschung 21, 1028-1041.
3. Laird, P.W. (2010). Prinzipien und Herausforderungen der genomweiten DNA-Methylierungsanalyse. Naturwissenschaftliche Rezensionen Genetik 11, 191-203.
4. Su, J. (2012). Fortschritte bei Bioinformatik-Tools für Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten der DNA-Methylierung. Erblichkeitsgenetik 01.
5. Taiwo, O., Wilson, G.A., Morris, T., Seisenberger, S., Reik, W., Pearce, D., Beck, S., und Butcher, L.M. (2012). Methylom-Analyse mittels MeDIP-seq bei niedrigen DNA-Konzentrationen. Naturprotokolle 7, 617-636.
6. Weber, M., Davies, J.J., Wittig, D., Oakeley, E.J., Haase, M., Lam, W.L., und Schubeler, D. (2005). Chromosomenweite und promoter-spezifische Analysen identifizieren Stellen mit unterschiedlicher DNA-Methylierung in normalen und transformierten menschlichen Zellen. Naturgenetik 37, 853-862.
7. Zhang, Y., Gou, W., Ma, J., Zhang, H., Zhang, Y. und Zhang, H. (2017). Genom-Methylierung und regulatorische Funktionen für die hypoxische Anpassung bei tibetischen Hühnereiern. PeerJ 5, e3891.
8. Zhao, M.T., Whyte, J.J., Hopkins, G.M., Kirk, M.D. und Prather, R.S. (2014). Methylierte DNA-Immunpräzipitation und Hochdurchsatz-Sequenzierung (MeDIP-seq) unter Verwendung geringer Mengen genomischer DNA. Zelluläre Reprogrammierung 16, 175-184.