Ein Überblick über hMeDIP-Seq, Einführung, Hauptmerkmale und Anwendungen

Für das Studium von 5hmC-Modifikationen, hMeDIP-Seq wird genutzt. Es handelt sich um eine kleine Änderung von MeDIP-seq, das sich auf das ursprüngliche MeDIP-Verfahren konzentriert. Obwohl diese Technik theoretisch nahezu identisch mit MeDIP-seq ist, wird sie aufgrund des erheblich unterschiedlichen biologischen Wissens, das sie bietet, als ein anderes Verfahren betrachtet. Beide Veränderungen von 5mC und 5hmC sollten bewertet werden, um ein detailliertes Verständnis der epigenetischen Veränderungen zu erlangen.

Durch Immunpräzipitation wird methyliertes DNA von genomischer DNA getrennt. Anti-5hmC-Antikörper werden subkultiviert und mit fragmentierter gDNA angeregt, nachdem die DNA gereinigt und eine Bibliothek für das Sequenzieren vorbereitet wurde. Tiefensequenzierung bietet eine höhere Abdeckung des Genoms und zeigt den Großteil der immunpräzipitierten hydroxymethylierten DNA.

Vorteile und Nachteile von hMeDIP-seq

Die Vorteile von hMeDIP-seq sind wie folgt:

• In dicken und weniger dicken Wiederholungsbereichen ist 5hmC abgedeckt.
• Antikörperbasierte Selektion ist aufgrund der Spezifität der Antikörper unabhängig von der Sequenz und erhöht nicht 5mC.

Andererseits umfasst es folgende Nachteile:

• Im Vergleich zur Einzelbasisauflösung mit anderen Techniken ist die Basenpaarauflösung geringer (~150 bp).
• Um unspezifische Interaktionen zu verhindern, müssen die Spezifität und Selektivität von Antikörpern bewertet werden.
• Voreingenommen gegenüber Bereichen, die hypermethylisiert sind.

Anwendungen und Forschung von hMeDIP-Seq

DNA-Methylierung an der 5-Position von Cytosin (5mC) ist eine wesentliche epigenetische Veränderung, die eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Säugetieren und der Zell-Differenzierung spielt. Forschungen haben gezeigt, dass die Familie der Ten-Eleven-Translokation (TET) Proteine diese offenbar stabile Modifikation durch Oxidation entfernen kann. 5mC-5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-Formylcytosin (5fC) und 5-Carboxylcytosin (5caC) werden von TET-Proteinen oxidiert (5caC). 5hmC ist der am häufigsten vorkommende Bestandteil in vivo unter den drei 5mC-oxidativen Derivaten und kann in fast allen Säugetiergeweben und -zellen nachgewiesen werden. 5hmC wird mittlerweile als eine epigenetische Veränderung angesehen, da es als einer der Zwischenzustände der DNA-Demethylierung betrachtet wird.

Abbildung 1. Eine Darstellung des Cytosin-Methylierungszyklus. (Ecsedi, 2018)

Die genomweite Kartierung von 5mC und 5hmC deckt die genomischen Bereiche dieser Veränderungen auf, was entscheidend ist, um ihre Mechanismen zu erhellen. Um die genomweite Verteilung von 5hmC in Gehirngeweben und embryonalen Stammzellen zu charakterisieren, haben zahlreiche Gruppen 5hmC-spezifische Affinitäts-Pull-Down-Methoden in Verbindung mit Next-Generation Sequencing (NGS) oder Tiling-Arrays verwendet. Dennoch bleibt es schwierig, DNA-Hydroxymethylom-Daten, die durch die standardisierte hMeDIP-seq-Methode gesammelt wurden, für einen direkten genomweiten Vergleich zwischen hoch- und niedrig-5hmC-Proben zu nutzen, aufgrund einiger Einschränkungen, die in dem standardisierten hMeDIP-seq-Verfahren verankert sind. Zum Beispiel stellt das bestehende standardisierte Illumina NGS-Verfahren sicher, dass die gleiche Anzahl von DNA-Bibliotheken für die Erzeugung unterschiedlicher Cluster und Sequenzierungsproben geladen wird, was die Unterschiede im hMeDIP-Produkt zwischen verschiedenen Proben (insbesondere für solche mit unterschiedlicher 5hmC-Häufigkeit) negiert. In diesem Zusammenhang können die verschiedenen Phasen des standardisierten hMeDIP-seq-Verfahrens die experimentelle Varianz zwischen den Proben erhöhen, einschließlich hMeDIP, Bibliothekskonstruktion, Cluster-Hybridisierung und Sequenzierung. Elegante rechnerische Techniken wurden von vielen Laboren entwickelt, um die aus verschiedenen Proben erzeugten DNA-Methylom-Daten zu stabilisieren oder zu modifizieren. Dennoch wurde die Verzerrung, die durch die intrinsischen Einschränkungen der standardisierten MeDIP-seq- oder hMeDIP-seq-Methoden verursacht wird, noch nicht überwunden. Um diese technischen Probleme zu überwinden, erfordert die dramatische Variation der 5hmC-Spiegel zwischen verschiedenen Geweben und Zellen oder während der Zell-Differenzierung und Embryonalentwicklung innovative Strategien und Techniken.

Die DNA-Hydroxymethylome von Maus-ES-Zellen (ESCs) und aus Maus-ESCs extrahierten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) wurden in einer aktuellen Untersuchung mittels hMeDIP-seq identifiziert und bewertet. Die Wissenschaftler konnten verschiedene hydroxymethylierte Bereiche (DHMRs) zwischen ESCs und NPCs identifizieren und entdeckten eine komplexe Verbindung zwischen der DNA-Hydroxymethylierungsmodifikation und den Veränderungen der Genexpression während des Engagements der neuralen Linie von ESCs.

Referenzen:

1. Ecsedi S, Rodríguez-Aguilera JR, Hernandez-Vargas H. 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC), oder wie man seine Lieblingszelle identifiziert. Epigenome2018, 2(1):3.
2. Feldmann A, Ivanek R, Murr R, u. a. Die Besetzung von Transkriptionsfaktoren kann den aktiven Austausch von DNA-Methylierung in regulatorischen Regionen vermitteln. PLoS Genetik2013, 9(12).
3. Tan L, Xiong L, Xu W, u. a. Genomweite Vergleich der DNA-Hydroxymethylierung in Maus-embryonalen Stammzellen und neuralen Vorläuferzellen mittels einer neuen vergleichenden hMeDIP-seq-Methode. Nukleinsäureforschung2013, 41(7).
4. Stroud H, Feng S, Kinney SM, u. a.5-Hydroxymethylcytosin ist mit Enhancern und Genkörpern in menschlichen embryonalen Stammzellen assoziiert. Genombiologie2011,12(6).