Anwendung der PCR-Produkt-Sanger-Sequenzierung

PCR, eine weit verbreitete Technik zur Genklonierung, ermöglicht die effiziente in vitro-Replikation spezifischer DNA-Fragmente. Durch die Nutzung der PCR-Technologie können wir Zielgene auf ausreichende Mengen amplifizieren, um den Anforderungen nachfolgender Sequenzierungen und Analysen gerecht zu werden.

In der aktuellen Forschung gibt es typischerweise zwei Hauptmethoden zur Sequenzanalyse von PCR-Produkten. Erstens wird die direkte Sanger-Sequenzierung eingesetzt, die sich zur Erkennung von Genmutationen mit klaren Loci eignet, wie zum Beispiel bei bestimmten monogenen Erbkrankheiten und der Identifizierung mikrobieller Populationen, HLA-Typisierung (PCR-SBT) und anderen. Zweitens werden PCR-Produkte einer Vektorkonstruktion unterzogen, wobei häufig T-Vektoren verwendet werden, gefolgt von einer Transformation in Escherichia coli. Die anschließenden Schritte umfassen Kultur, Kolonienauswahl und die Sequenzierung einzelner Klone mit eingehender Analyse.

Der Anwendungsbereich der direkten PCR-Produkt-Sequenzierungstechnologie ist umfangreich. Sie wird nicht nur zur Erkennung von Genmutationen eingesetzt, sondern auch zur Identifizierung mikrobieller Populationen, zur HLA-Typisierung und zur Validierung von NGS-Ergebnissen, was eine solide Unterstützung für wissenschaftliche Forschungsprojekte bietet.

Anwendung der Sanger-Sequenzierung in der PCR-Produktanalyse

Mutationsnachweis

Mutations führen zu Variabilität in DNA-Sequenzen. Sanger-SequenzierungAls effiziente und präzise Nachweismethode identifiziert sie diese Mutationen effektiv, einschließlich einzelner Nukleotidpolymorphismen (SNPs), Insertionen und Deletionen. Der Nachweis von Mutationen spielt eine unverzichtbare Rolle in wichtigen Forschungsbereichen wie erblichen Krankheiten und Krebs.

Der grundlegende Prozess der Mutationsdetektion ist wie folgt skizziert:

Zunächst werden spezifische Primer für Ziel-exonische Sequenzen entworfen, die anfällig für Mutationen sind, um eine genaue Erfassung des Zielbereichs sicherzustellen. Anschließend wird DNA aus der Probe extrahiert, um als Ausgangsmaterial für die nachfolgenden Experimente zu dienen.

Als nächstes werden die Ziel-DNA-Sequenzen mithilfe von PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert, und die Amplifikationsprodukte werden gereinigt, um den Einfluss von unspezifischer Amplifikation und Verunreinigungen zu beseitigen. Nach der Reinigung der Amplifikationsprodukte werden deren Größen durch Methoden wie Gel-Elektrophorese bestimmt, um sicherzustellen, dass die Produkte den Erwartungen entsprechen.

Anschließend, Sanger-Sequenzierung Die Amplifikationsprodukte werden analysiert, um DNA-Sequenzinformationen aus dem Zielbereich zu erhalten. Nach Abschluss der Sequenzierung wird das erhaltene Sequenz-Chromatogramm mit der Referenzsequenz des Zielgens verglichen und analysiert, um vorhandene Mutationsstellen und deren Typen zu identifizieren.

Schließlich können zur Sicherstellung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Sequierungsergebnisse optionale Validierungsschritte nach der Sequierung durchgeführt werden. Dies kann durch Methoden wie fluoreszierende Quantifizierungsnachweiskits (unter Verwendung der ARMS-Methode mit einer Empfindlichkeit von 1%) erreicht werden, um die Genauigkeit der Ergebnisse zur Mutationsdetektion weiter zu validieren.

Methoden zur Detektion von BRAF-Mutationen. (a) Vergleichende Bewertung der Tiefe und Breite von Methoden zur Detektion von BRAF-Mutationen. (b) Mechanismus der Blocker-Displacement-Amplifikation (BDA) zur Anreicherung von Varianten. Der Blocker bindet selektiv an und hemmt die PCR-Amplifikation von Wildtyp (WT) DNA-Sequenzen, wodurch die bevorzugte Amplifikation von BRAF-Mutationen erleichtert wird. (c) Arbeitsablauf des BDA-Mutationsnachweis-Assays. Der BDA-Assay wird zunächst in quantitativer PCR (qPCR) durchgeführt, gefolgt von der Sanger-Sequenzierung der Amplifikate, um die spezifische Mutation zu identifizieren.

Mikrobenidentifikation

Mikrobenidentifikation Bemühungen, eine präzise Charakterisierung und Klassifizierung verschiedener Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, Pilzen, Viren und Parasiten, zu erreichen, unter Verwendung von Sanger-SequenzierungNachfolgend finden Sie eine prägnante Darstellung des Identifikationsprotokolls:

Zunächst erfolgt das sorgfältige Design spezifischer Primer, die repräsentative konservierte Regionen innerhalb der interessierenden mikrobiellen DNA anvisieren, wie zum Beispiel die 16S rDNA für Bakterien oder die ITS-Region für Pilze.

Nach dem Entwurf der Primer wird eine effiziente Amplifikation der konservierten Regionen unter Verwendung der PCR-Technologie durchgeführt, um eine ausreichende Menge an DNA-Fragmenten zu erzeugen, die für die nachgelagerte Analyse erforderlich sind.

Nach erfolgreicher Amplifikation folgt die Sequenzierung der PCR-Produkte der ersten Generation, um die DNA-Sequenzen genau zu bestimmen und damit die genetische Zusammensetzung der Zielmikroorganismen zu erhellen.

Nach der Beschaffung der Sequenzierungsergebnisse werden rigorose Sequenzanpassungen und Analysen gegen weltweit anerkannte Gen-Datenbanken wie NCBI GenBank durchgeführt. Diese sorgfältige Anpassung ermöglicht die Bestimmung von Beziehungen zwischen Mikrobenarten.

Der gesamte Identifizierungsprozess ist durch seine strenge und methodische Natur gekennzeichnet, die die Präzision und Zuverlässigkeit der Identifizierungsergebnisse gewährleistet und somit eine solide Unterstützung für die mikrobielle Forschung und praktische Anwendungen bietet.

Quantifizierung bakterieller Gemeinschaften durch Sanger-Sequenzierung. Hier quantifizieren die Autoren die Ampliconzusammensetzung in synthetischen bakteriellen Gemeinschaften durch Sanger-Sequenzierung. Sie amplifizieren ein universelles Marker-Gen mittels PCR und sequenzieren anschließend dieses Amplicon-Gemisch in einer einzigen Sanger-Sequenzierungsreaktion.

HLA-Typisierung

Im Vergleich zu PCR-basierten Methoden wie PCR-sequenzspezifischen Oligonukleotid-Sondenassays (niedrige Auflösung) und PCR-sequenzspezifischer Primer-Genamplifikation (mittlere Auflösung) bietet das PCR-basierte direkte Sequenzierungstyping (sequenzbasiertes Typing, SBT) eine höhere Auflösung. Unter diesen Techniken dient die klassische Sanger-Sequenzierung als optionale Sequenzierungsansatz für das PCR-basierte direkte Sequenzierungstyping.

Der Arbeitsablauf ist wie folgt skizziert: Zunächst werden standortspezifische Primer verwendet, um kritische HLA-Loci selektiv zu amplifizieren und so die präzise Erfassung der Zielsequenzen sicherzustellen. Anschließend werden die amplifizierten Produkte einer Analyse unterzogen. Sanger-Sequenzierung um umfassende Basissequenzinformationen zu erhalten. Schließlich werden die Sequenzierungsergebnisse mithilfe von Software gründlich analysiert, um zu gewinnen Hochauflösende HLA-Genotypisierung Information. Während dieses Prozesses werden die Sequenzierungsergebnisse mit bekannten HLA-Datenbanken abgeglichen, um das spezifische HLA-Genotyp eines Individuums genau zu bestimmen und die Entdeckung neuer allelischer Variationen zu unterstützen.

Vergleichende Analyse von NGS- und Sanger-Sequenzierungsmethoden für HLA-Typisierung

Validierung von NGS-Ergebnissen

Angesichts der vielschichtigen Unsicherheiten, die die Genauigkeit von NGS, die sich aus Variablen wie gezielten Anreicherungssystemen, Sequenzierungsplattformen, bioinformatischen Pipelines und Fachwissen zur Varianteninterpretation ergeben, sind zuverlässige Validierungstools für den vergleichenden Nachweis unverzichtbar. Unter diesen, Sanger-Sequenzierung Die Technologie, die für ihre Fähigkeit bekannt ist, einen einzelnen DNA-Strangabschnitt mit einer Genauigkeit von bis zu 99,99 % zu sequenzieren, wird allgemein anerkannt und konstant als der Goldstandard für die Validierung eingesetzt.

Der Validierungsprozess wird wie folgt zusammengefasst:

Zunächst eine präzise Primer-Design, das auf die identifizierten Variantenloci abzielt von NGS Die Detektion gewährleistet die genaue Erfassung der Zielregionen. Anschließend werden durch Amplifikation der Zielsegmente und Reinigung der Produkte hochwertige Sequenzierungsvorlagen gewonnen. Als Nächstes, Sanger-Sequenzierung Technologie wird eingesetzt, um die verarbeiteten Vorlagen zu sequenzieren, was detaillierte Sequenzinformationen liefert. Schließlich bestätigt eine gründliche Analyse der Sanger-Sequenzierungsergebnisse in Bezug auf variant loci deren Konsistenz mit den NGS-Ergebnissen. Durch diesen rigorosen Validierungsprozess können wir die Zuverlässigkeit der NGS-Ergebnisse genauer bewerten und bieten damit eine solide Grundlage für nachfolgende wissenschaftliche Forschungen oder klinische Entscheidungsfindungen.

Mitochondriale DNA-Sequenzierung

Mitochondriale DNA-Sequenzierung ist eine präzise analytische Technik, die auf spezifische Loci abzielt. Im Falle von Verdacht auf mitochondriale Genmutationen werden zunächst periphere venöse Blutproben von den Patienten entnommen, aus denen genomische DNA extrahiert wird. Anschließend werden fortgeschrittene NGS Die Technologie untersucht umfassend die gesamte mitochondriale Genomsequenz des Patienten. Basierend auf diesen vorläufigen Erkennungsergebnissen wird eine weitere Validierungsanalyse der mitochondrialen DNA des Patienten durchgeführt, indem die Sanger-Sequenzierung Methode an Proben, die von den Eltern und Geschwistern des Patienten entnommen wurden, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Ergebnisse sicherzustellen. Durch diese Reihe strenger Sequenzierungsprozesse wird robuster molekulargenetischer Nachweis für die klinische Diagnose und Behandlung erbracht.

Angesichts des angesehenen Rufs der Sanger-Sequenzierung für ihre herausragenden hochpräzisen Eigenschaften liegt ihr zentrales Erkennungsprinzip in der Fähigkeit, DNA-Sequenzen Basen für Basen genau zu lesen. Daher ist eine sorgfältige Kontrolle der Qualität von PCR-Produkten, einschließlich ihrer Konzentration und Reinheit, entscheidend für den Erfolg der Sanger-Sequenzierung.

Sanger-Sequenzierung von mtDNA. Elektropherogramme, die durch Sanger-Dideoxy-Sequenzierung von mtDNA erzeugt wurden, die aus drei alten Knochenfunden in einem Grab aus dem 10. Jahrhundert in Sigtuna, Mittelschweden, extrahiert wurden. (Martina Nilsson)

Optimierung der Sanger-Sequenzierung: Fehlersuche bei häufigen Problemen

Während der Vorbereitungsphase von Sanger-SequenzierungDie kontinuierliche Optimierung der experimentellen Bedingungen ist notwendig, um die Sequenzqualität und -genauigkeit zu maximieren. Dies umfasst unter anderem die Feinabstimmung des Designs von PCR-Primern und die präzise Anpassung der PCR-Reaktionsbedingungen. Darüber hinaus ist die Reinigung der Produkte nach der PCR-Reaktion unerlässlich. Dieser Schritt zielt darauf ab, Verunreinigungen wie unspezifisch amplifizierte Fragmente und Primersequenzen effektiv zu entfernen, um die Genauigkeit der Zielgen-Sequenz sicherzustellen.

In der praktischen Anwendung können jedoch Faktoren wie die Konzentration, Reinheit und Struktur der zu sequenzierenden PCR-Produkte zu einer Reihe von suboptimalen Sequenzierungsergebnissen führen. Um dem entgegenzuwirken, haben wir eine Liste häufiger Probleme und entsprechender Lösungsstrategien zur praktischen Referenz zusammengestellt.

Referenzen:

1. Cheng, L.Y., Haydu, L.E., Song, P. et al. Hochsensitives Sanger-Sequencing zur Detektion von BRAF-Mutationen in FFPE-Gewebeproben bei metastasierendem Melanom. Wissenschaftliche Berichte 11, 9043 (2021).
2. Cermak N, Datta MS, Conwill A. Schnelle, kostengünstige Messung der synthetischen bakteriellen Gemeinschaftszusammensetzung durch Sanger-Sequenzierung von Amplicon-Mischungen. iWissenschaft. 2020
3. Syndercombe Court D. Mitochondriale DNA in der forensischen Anwendung. Notfall Top Lebenswissenschaften. 2021