Die Prinzipien und der Workflow von SNP-Mikroarray

Was ist ein SNP-Mikroarray?

SNP-Mikroarray, eine spezialisierte Art der Mikroarray-Technologie, ist auf die Erkennung von Einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) ausgerichtet, die Variationen an einem einzelnen Basenpaar im Genom charakterisieren. In den letzten Jahren entstanden, SNP-Mikroarray Technologie stellt eine Hochdurchsatz-Plattform für großangelegte genetische Tests dar. Das Arbeitsprinzip besteht hauptsächlich in der Hybridisierung von fragmentierter einzelsträngiger DNA mit einem Array, das aus Hunderttausenden einzigartiger Nukleotid-Probensequenzen besteht.

Einzelne Nukleotid-Polymorphismus (SNP) bezieht sich auf die Unterschiede eines einzelnen Nukleotids an derselben Stelle in der genomischen DNA-Sequenz. Im Allgemeinen wird eine einzelne Nukleotidvariation mit einer Häufigkeit von mehr als 1 % als SNP bezeichnet. Die SNPs betreffen nur eine einzelne Basenvariation, die durch einen einzelnen Basenübergang oder eine Transversion verursacht werden kann. Es gibt ungefähr einen SNP pro 1000 Basen im menschlichen Genom, und die Gesamtzahl der SNPs im menschlichen Genom liegt bei etwa 3 x 10^6.

SNPs sind zur dritten Generation genetischer Marker geworden. Die Eigenschaften von SNPs machen sie geeigneter für Studien zur genetischen Pleiotropie bei komplexen Merkmalen und Krankheiten sowie zur populationsbasierten Genidentifikation als andere polymorphe Marker. SNPs haben eine bedeutende Rolle in der biomedizinischen Forschung. SNPs wurden in genomweiten Assoziationsstudien als hochauflösende Marker in der Genkartierung im Zusammenhang mit Krankheiten oder normalen Merkmalen verwendet. SNPs ohne beobachtbaren Einfluss auf den Phänotyp (sogenannte stille Mutationen) können ebenfalls nützlich sein, aufgrund ihrer Anzahl und stabilen Vererbung über Generationen hinweg.

Abbildung 1. Das obere DNA-Molekül unterscheidet sich an einer einzigen Basenpaarstelle (einem C/A-Polymorphismus) vom unteren DNA-Molekül.

Die DNA Mikroarray bezieht sich auf einen Genchip mit einer großen Anzahl von Sonden-DNA-Sequenzen in einer spezifischen Anordnung, die auf einem festen Substrat immobilisiert sind. Das Prinzip basiert auf der Theorie der Nukleinsäurehybridisierung, und die detektierte Proben-DNA wird mit dem DNA-Mikroarray hybridisiert und verlängert. Anschließend werden die Fragmente der nicht-komplementären Bindungsreaktion auf dem Chip weggewaschen, und der Genchip wird einer laserkonfokalen Abtastung unterzogen. Die Fluoreszenzsignalintensitäten werden dann gemessen und als Häufigkeit verschiedener Gene durch bestimmte Datenverarbeitung interpretiert.

Prinzipien von SNP-Mikroarray

Das grundlegende Prinzip von SNP-Mikroarray umfasst eine einzelne Hybridisierungsstrategie, bei der DNA-Proben zur Analyse mit auf dem Chip integrierten Sonden hybridisiert werden. Die Kopienanzahl an jedem Locus kann anschließend bestimmt werden, indem die Signalintensitäten über verschiedene Proben hinweg verglichen werden.

SNP-Mikroarray nutzen Sie die Unterschiede in SNP-Loci zwischen Individuen aus. Konventionell basiert die Erkennung von SNP-Stellen auf der Ausrichtung von DNA-Sequenzen. Innerhalb SNP-MikroarrayEs werden Sonden mit unterschiedlichen SNP-Variationen verwendet. Diese Sonden passen spezifisch zu den SNP-Stellen. Durch die Hybridisierung von DNA aus den Proben kann der Genotyp jeder SNP-Stelle bestimmt werden. Darüber hinaus kann die Häufigkeit verschiedener Genotypen durch die Messung der Signalintensität ermittelt werden.

Im Vergleich zu traditionellen Einzelzell-Diagnosemethoden, SNP-Mikroarray dient als ein Hochdurchsatzansatz, der in der Lage ist, Tausende von Reaktionen gleichzeitig auf der Oberfläche des Oligonukleotidchips durchzuführen.

Abbildung 2. Das Prinzip des Mikroarrays.

Workflow von SNP-Mikroarray

Der allgemeine Arbeitsablauf von SNP-Mikroarray ist in Abbildung 3 dargestellt. Kurz gesagt, gibt es mehrere Prozesse: Herstellung des SNP-Chips, Vorbereitung der genomischen DNA-Proben, Hybridisierung und Fluoreszenz-Scanning.

Abbildung 3. Der Arbeitsablauf des SNP-Mikroarrays.

Sondenentwurf

Der Prozess umfasst die Sammlung von genomischen Sequenzinformationen von den Zielorten der Einzelnen Nukleotid-Polymorphismen (SNP). Bekannte SNP-Informationen werden dann mit der Referenzgenomsequenz ausgerichtet, was die Position und die variablen Basen der SNP-Stellen bestimmt. Unter Verwendung der Sequenzinformationen um die SNP-Stellen werden eine Reihe spezifischer Sonden entworfen. Dies gewährleistet, dass die Sonden selektiv mit den variablen Basen an den Ziel-SNP-Stellen paaren.

Bei der Gestaltung der Sonden werden In-vitro-Experimente durchgeführt, um die Hybridisierungsleistung der Sonden zu bewerten, einschließlich der Hybridisierungseffizienz unter Bedingungen wie Temperatur und Salzkonzentration. Die Länge der Sonden wird kontrolliert und liegt typischerweise zwischen 20 und 70 Basen, um eine stabile Hybridisierung und eine zuverlässige Signalübertragung zu gewährleisten. In der Entwurfsphase der Sonden wird auch die umgekehrte Komplementärsequenz des Ziel-SNP-Standorts berücksichtigt, um die bidirektionale Mutationsdetektion zu erleichtern.

SNP-Chip-Herstellung

Die vordefinierten Oligonukleotid- oder cDNA-Chips sind geordnet und in hoher Dichte auf dem Glasträger angeordnet, um Mikroarrays oder Kernchips zu erstellen. Die Herstellungsverfahren des Chips umfassen lichtgeführte In-situ-Synthese, chemisches Sprühverfahren, Kontaktpunktbeschichtungsverfahren, In-situ-DNA-kontrollierte Synthese, kontaktloses mikromechanisches Druckverfahren TOPSPOT® und weiche Lithografie-Reproduktion usw. Insgesamt können jetzt 4x10^5 verschiedene DNA-Moleküle auf einem 1 cm² großen Chip platziert werden. Die Affymetrix GeneChip®-Technologie ermöglicht eine hohe Dichte, in situ Oligonukleotidsynthese und war ein Pionier auf diesem Gebiet.

Probenvorbereitung von genomischer DNA

Bei der Vorbereitung von genomischen DNA-Proben ist ein erster Schritt, geeignetes Probenmaterial zu beschaffen. Anschließend ist es unerlässlich, genomische DNA zu extrahieren und diese dann mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Schließlich werden die Proben durch den Einsatz verschiedener fluoreszierender Farbstoffe für weitere Analysen markiert.

Die Konzentration und Reinheit der DNA-Proben sind von größter Bedeutung. Diese können mit spektrophotometrischen Techniken wie Kolorimetrie, ultravioletter Absorptionsspektroskopie oder Assays unter Verwendung fluoreszierender Farbstoffe gemessen werden. Solche Verfahren stellen sicher, dass die extrahierte DNA von ausreichender Qualität ist und keine offensichtliche Kontamination aufweist. Darüber hinaus wird entsprechend den experimentellen Anforderungen eine geeignete Markierungsmethode gewählt. Häufig verwendete Markierungstechniken umfassen Fluoreszenzmarkierung, Biotinmarkierung sowie die Markierung mit radioaktiven Isotopen.

Hybridisierung und Scan

Übergehen zur Hybridisierung und Scannen, hybridisiert die fluoreszenzmarkierte genomische DNA mit der SNP-Mikroarray unter geeigneten Reaktionsbedingungen. Nach dem Waschen wird die Fluoreszenz mit einem speziell entwickelten Fluoreszenzscanner gescannt. Anschließend werden die Daten durch computerbasierte Bildanalyse verarbeitet und anschließend zur bioinformatischen Analyse der Zielgene eingereicht.

Zunächst ist das Ausmaß der Optimierung verschiedener Hybridisierungsbedingungen – wie Temperatur, Salzkonzentration und Hybridisierungszeit – von größter Bedeutung, um eine ausreichende Bindung von DNA an die Sonden sicherzustellen. Anschließend sollten während der Elution die Elutionsbedingungen sorgfältig kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass nur DNA, die mit der Sonde bindet, auf dem Chip verbleibt, wodurch die Möglichkeit verhindert wird, dass ungebundene DNA die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigt.

Vorteile und Einschränkungen von SNP-Mikroarray

Die Vorteile dieses Verfahrens umfassen die Fähigkeit, mehrere SNP-Stellen gleichzeitig schnell zu detektieren, was eine große Menge an SNP-Daten in einem einzigen Experiment liefert. Dieses Verfahren ist in einem breiten Spektrum von Bereichen anwendbar, wie z.B. in der genombasierten Forschung, der Analyse individueller Genotypen und Studien zur Krankheitsanfälligkeit, und es bietet ein höheres Maß an Genauigkeit bei der Erkennung von Kopienzahlvariationen als die Next-Generation-Sequenzierung, einschließlich der Gesamten Genomsequenzierung (WGS). Es weist auch eine höhere Auflösung auf als Array comparative Genom-Hybridisierung (aCGH), in der Lage, heterozygote neutrale Verlust von Kopienzahlen, bestimmte Formen der uniparentalen Disomie und Veränderungen in der Ploidie zu erkennen.

Es gibt jedoch Einschränkungen, da diese Methode durch bekannte SNP-Informationen begrenzt ist und unbekannte SNP-Mutationen nicht erkennen kann. Labeling-Methoden können Verzerrungen einführen und die Genauigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Darüber hinaus erfordert die Verarbeitung umfangreicher Daten komplexe Analysemethoden und Berechnungen, und die Kosten für die Chipvorbereitung, Reagenzien und Ausrüstung sind relativ hoch.

Anwendung von SNP-Mikroarray

SNP-Mikroarray sind ein häufig eingesetztes Instrument in verschiedenen Bereichen, einschließlich genomischer Forschung, personalisierter Medizin, Krankheitsdiagnose und Arzneimittelentwicklung.

SNP-Genotypisierung, der Prozess der Identifizierung der genetischen Varianten eines Individuums, ermöglicht es uns, die genetischen Merkmale einer Person zu bestimmen, einschließlich verschiedener Allele an verschiedenen Loci im gesamten Genom. Darüber hinaus können wir durch die Analyse der Häufigkeitsverteilung von SNP-Loci in verschiedenen Populationen oder ethnischen Gruppen Einblicke in die genetische Struktur und die evolutionäre Geschichte dieser Gruppen gewinnen.

Vergleichende Analyse von SNP-Mikroarray Daten zwischen Patienten mit einer Erkrankung und gesunden Kontrollteilnehmern können SNP-Loci identifizieren, die mit genetischen Störungen assoziiert sind, und bieten somit einen Einblick in die genetischen Grundlagen der Krankheit. Die SNP-Technik eröffnet uns Möglichkeiten, Korrelationen mit komplexen Krankheiten (wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, psychischen Störungen usw.) zu entdecken und ihre genetischen Risikofaktoren zu erforschen.

Eine Analyse des genetischen Profils des Patienten bietet eine Möglichkeit, ihre Anfälligkeit für Umwelteinflüsse und Krankheitsdispositionen vorherzusagen, wodurch eine Grundlage für personalisierte Krankheitsprävention und Gesundheitsmanagement geschaffen wird. Sie wird verwendet, um genomische strukturelle Variationen wie SNPs und CNVs zu erkennen, die die Struktur und Funktion des Genoms offenbaren.

Abbildung 4. Ganzgenomansicht von einem SNP-Mikroarray, der auf dem diagnostischen Knochenmarksspezimen durchgeführt wurde, das zur Untersuchung von ALL eingereicht wurde. (Berry et al., 2019)

Zusätzlich, SNP-Mikroarray werden weit verbreitet eingesetzt in genomweite Assoziationsstudien (GWAS)Durch die Analyse von SNPs in großen Stichproben können Forscher SNP-Loci identifizieren, die mit bestimmten Phänotypen oder Krankheiten in Verbindung stehen, und deren genetische Grundlage untersuchen.

In den letzten Jahren wurden Methoden entwickelt, die auf... SNP-Mikroarray sind in die pränatale Diagnostik integriert worden. Dies ist hauptsächlich auf die Fähigkeit der SNP-Analyse zurückzuführen, Regionen der Homozygosität (ROH), unausgeglichene Translokationen und andere Aspekte bei der Diagnose genomischer Erkrankungen zu diagnostizieren. Diese Techniken bieten erhebliche Vorteile gegenüber der traditionellen chromosomalen Karyotypanalyse und kennzeichnen sich als unverzichtbare genetische Diagnosetechnologien der ersten Linie in modernen klinischen Einrichtungen.

Unterschied zwischen CGH- und SNP-Mikroarray

Die Technologien von CGH-Mikroarrays und SNP-Mikroarrays spielen eine entscheidende Rolle in der Genom-Analyse. Es bestehen jedoch Unterschiede in ihren Prinzipien, Anwendungen, Vorteilen und Nachteilen.

Prinzipien:

CGH-MikroarrayEingesetzt zur Erkennung Kopienzahlvariationen (CNV) Innerhalb der genomischen DNA beinhaltet das Prinzip der CGH die gleichzeitige Markierung der Proben-DNA und der Referenz-DNA, gefolgt von deren Hybridisierung auf dem Chip. Kopienzahlvariationen in der Proben-DNA können bestimmt werden, indem die Signalintensität zwischen der Proben-DNA und der Referenz-DNA verglichen wird.

SNP-MikroarrayDas SNP-Mikroarray ist hauptsächlich zur Identifizierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) konzipiert, d.h. Variationen an einzelnen Basenpaaren im Genom. Das zugrunde liegende Prinzip besteht darin, die Proben-DNA mit SNP-Sonden auf dem Chip zu hybridisieren und die Genotypen an jedem SNP-Locus durch die Signalstärke der Hybridisierung zwischen der Sonde und der Proben-DNA zu bestimmen.

Anwendungen:

CGH-MikroarrayDie Hauptanwendung besteht darin, CNVs zu erkennen, wie z. B. Genverdopplungen, -deletion oder -amplifikation, und chromosomale strukturelle Variationen zu identifizieren. Es wird häufig in der Krebsgenomforschung und der Diagnose genetischer Störungen eingesetzt.

SNP-MikroarrayHauptsächlich verwendet zur Erkennung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen, einschließlich Genotypidentifikation, individueller genomischer Analyse, Forschung zur Anfälligkeit, Analyse der genetischen Struktur von Populationen usw. Es hat eine umfassende Anwendung in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS).

Vorteile und Nachteile:

CGH-MikroarrayVorteile: Es ermöglicht die gleichzeitige Erkennung von großen CNV Segmente im Genom mit einer breiten Abdeckung, die sich zur Entdeckung neuer CNVs eignet. Nachteile: Es bietet keine detaillierten SNP-Daten und ist daher nicht in der Lage, Variationen auf Einzelbasenpaar-Ebene zu erkennen, was eine relativ schwache Fähigkeit zur Erkennung von Variationen in kleinen Fragmenten zeigt.

SNP-MikroarrayVorteile: Es liefert direkte SNP-Daten, was es für die individuelle Genotypisierung und krankheitsbezogene Studien geeignet macht, mit hoher Auflösung und Spezifität. Nachteile: Es kann nur bekannte SNP-Standorte erkennen und bietet keine Informationen über unbekannte Variationen und direkte CNV-Erkennung.

Bei CD Genomics sind wir darauf spezialisiert, zuverlässige SNP-Genotypisierungsdienste anzubieten, einschließlich Genotypisierung durch Sequenzierung, SNP-Mikroarray, MassARRAY SNP-Genotypisierung, SNaPshot-Multiplex-System für SNP-Genotypisierung, und TaqMan SNP-Genotypisierung.

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