Ribosomen-Profiling-Protokoll

Einführung in das Ribosomen-Profiling

Ribosomen-Profilinghäufig als bezeichnet Ribo-Seq, steht als eine wirkungsvolle Technik, die in der Untersuchung der Translation eingesetzt wird, dem komplexen Prozess, durch den Ribosomen die Synthese von Proteinen aus mRNA-Vorlagen orchestrieren. Diese hochmoderne Methode bietet einen Überblick über die Positionen der Ribosomen entlang der mRNAs, wodurch Wissenschaftler den Übersetzungsstatus einzelner mRNAs analysieren und deren Effizienz bewerten können. Ribosomen-Profiling umfasst die Erfassung und Sequenzierung von mRNA-Fragmenten, die durch Ribosomen geschützt sind. Als ribosomengeschützte Fußabdrücke (RPFs) bezeichnet, kennzeichnen diese Fragmente die genauen Positionen der Ribosomen auf mRNAs und bieten wertvolle Einblicke in die Dynamik der Translation. Das Hauptziel besteht darin, die Präsenz von Ribosomen während des Transkriptomletztendlich die Gene offenlegend, die aktiv übersetzt werden, und das Tempo, mit dem dieser Prozess abläuft.

Das detaillierte Protokoll für Ribosomen-Profiling lautend wie folgt:

Ribosomen-Profiling Bibliotheksvorbereitung

Zytosolische Fraktionierung

Extrahieren Sie die zytosolische Fraktion (Endvolumen von 600 μL) unter Verwendung des hypotonischen Lysepuffers ohne RNase-Inhibitor. Halten Sie 4 °C im kalten Raum, um unerwünschten mRNA-Abbau während des Prozesses zu vermeiden.

RNase I-Footprinting und Ribosomenrückgewinnung

1. Nehmen Sie 600 μL der zytosolischen Fraktion und fügen Sie 7,5 μL RNase I (100 U/μL) hinzu.
2. 45 Minuten bei Raumtemperatur mit sanftem Mischen auf einem Nutator inkubieren.
3. Um die RNase I Verdauung zu stoppen, fügen Sie 10 μL SUPERase Inhibitor hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf die Röhrchen.
4. Führen Sie 15-45% Saccharose durch und bestätigen Sie eine effiziente RNase I Verdauung.
5. Sammeln und kombinieren Sie die Fragmente 6, 7 und 8. Die Fragmente 9-10 enthalten disom-geschützte mRNA-Abschnitte, die möglicherweise eine Ribosomenstillstand darstellen, und werden von unserer Analyse ausgeschlossen.
6. Fügen Sie 4,5 mL Trizol-LS zu den kombinierten Fraktionen (insgesamt 6 mL) hinzu und extrahieren Sie die gesamte RNA.

Fußabdruck-Gelreinigung

1. Fügen Sie 2× Denaturierungs-Ladepuffer zu jeder Probe hinzu.
2. Bereiten Sie 1 μL eines 26 nt und 34 nt RNA-Markers sowie 1 μL einer 10 bp DNA-Leiter als Kontrolle vor. Fügen Sie jeweils 4 μL von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 5 μL von 2× denaturierendem Ladepuffer hinzu.
3. Denaturieren Sie die Probe bei 80 °C für 90 Sekunden und übertragen Sie die Probe direkt auf Eis.
4. Trennen Sie die Probe mit einem 10% Polyacrylamid-TBE-Urea-Gel in 0,5× TBE-Puffer bei konstanter Leistung (5 W) für 80 Minuten, bis der Bromphenolblau-Farbstoff zwei Drittel des Gels erreicht. Das Spülen jedes Wells mit einer 0,5× TBE-Lösung mit einer Spritze vor dem Laden der Probe hilft, schön geformte Banden zu erzeugen.
5. Bauen Sie die Gelkassette vorsichtig auseinander und färben Sie das Gel 3 Minuten lang mit 1× SYBR Gold in 0,5× TBE-Puffer.
6. Entfernen Sie den Ribosomenfußabdruck (Bereich von 24-36 nt) und den 26 nt/34 nt Marker. Die hier extrahierten 26 nt/34 nt Fußabdrücke dienen als Kontrolle für die verbleibenden Schritte.
7. Übernachtige Gel-Extraktion. Fügen Sie 400 μL RNA-Gel-Extraktionspuffer hinzu und frieren Sie die Probe 30 Minuten auf Trockeneis ein. Lassen Sie die Probe über Nacht (15 Stunden werden empfohlen) bei sanftem Mischen stehen. Sammeln Sie die gesamte Lösung und übertragen Sie sie in RNase-freie Eppituben mit Antihaftbeschichtung. Fälligen Sie die Fußabdrücke, indem Sie 2 μL Glycoblue und 500 μL Isopropanol hinzufügen. Führen Sie die Fällung 30 Minuten oder länger auf Trockeneis durch. Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 Minuten mit einer Tischzentrifuge. Fußabdrücke landen häufig an den Seiten der Röhrchen. Wenn dies geschieht, resuspendieren Sie die Fußabdrücke und zentrifugieren Sie erneut. Entfernen Sie das Überstand vollständig und lassen Sie es 5 Minuten an der Luft trocknen. Lösen Sie die Fußabdrücke in 10 μL RNase-freiem Wasser auf.

Ribo-Zero rRNA-Depletion

1. Führen Sie die rRNA-Depletion mit dem Ribo-zero rRNA-Entfernungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
2. Konzentrieren Sie die rRNA-depletierten Proben gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers. Verwenden Sie beim letzten Elutionsschritt 8 μL RNase-freies Wasser, was 7 μL des endgültigen Eluats ergibt.

Dephosphorylierung, Linker-Ligation und Reinigung der linker-ligierten Produkte

1. Dephosphorylierungsreaktion. Mischen Sie 7 μL des rRNA-depletierten Footprints mit 1 μL PNK-Puffer. Inkubieren Sie bei 75 °C für 1 Minute und kühlen Sie auf Eis. Fügen Sie 1 μL SUPERase-Inhibitor und 1 μL T4 PNK hinzu. Inkubieren Sie 1 Stunde bei 37 °C (Gesamtvolumen: 10 μL). Nach Abschluss die Proben bei 65 °C für 3 Minuten inaktivieren und die Proben auf Eis kühlen.
2. Linker-Ligationsreaktion. Mischen Sie 10 μL der dephosphorylierten Produkte und 1 μL von Linker-1. Denaturieren Sie die Probe 90 s lang bei 80 °C und kühlen Sie sie sofort 10 Minuten auf Eis. Fügen Sie 1 μL T4 Rnl2-Puffer, 1 μL SUPERase-Inhibitor, 6 μL PEG8000 und 1 μL T4 RNA-Ligase 2 (verkürzt) hinzu. Inkubieren Sie 3 Stunden bei 25 °C.
3. Fügen Sie 30 μL RNase-freies Wasser zu jeder Probe hinzu und reinigen Sie das ligierte Produkt mit dem Zymo RNA Clean and Concentrator-5 Kit. Beachten Sie, dass das Kit effizient nicht-ligierte Linker entfernt. Eluieren Sie das ligierte Produkt im letzten Schritt in 11 μL einer 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) Lösung. Das endgültige Eluat beträgt -10 μL.

Reverse Transkription und Zirkularisierung

1. Fügen Sie 2 μL eines 0,25 μM Reverse-Transkriptionsprimers zu 10 μL des verlinkten Produkts hinzu.
2. Denaturieren Sie die Probe 2 Minuten lang bei 80 °C und kühlen Sie sie sofort auf Eis.
3. Fügen Sie 8 μL der Reverse-Transkriptase-Mastermischung zu jeder Probe hinzu, um eine Reaktion von 20 μL zu erhalten.
4. Hydrolysieren Sie die RNA-Vorlage, indem Sie 2,2 μL 1 N NaOH hinzufügen und 20 Minuten bei 90 °C inkubieren.
5. Fällen Sie das RT-Produkt aus. Fügen Sie 20 μL 3 M Natriumacetat (pH 5,5), 2 μL Glycoblue, 156 μL destilliertes Wasser, 300 μL Isopropanol hinzu und lassen Sie es 30 Minuten auf Trockeneis ausfällen. Zentrifugieren Sie die DNA 30 Minuten lang wie beschrieben und resuspendieren Sie das RT-Produkt in 10 μL destilliertem Wasser.
6. Bereiten Sie 2 μL einer 0,25 μM RT-Primer-Lösung (gemischt mit 3 μL von 10 nM Tris-HCl, pH 8,0 und 5 μL von 2× denaturierendem Ladepuffer) und 1 μL einer 10 bp DNA-Leiter als Kontrolle vor. Fügen Sie 10 μL von 2× Ladepuffer zu jeder Probe hinzu. Denaturieren Sie die Probe bei 80 °C für 90 s und kühlen Sie sie sofort auf Eis.
7. Trennen Sie die Probe mit einem 7,5% Polyacrylamid-TBE-Urea-Gel in 0,5× TBE-Puffer bei konstanter Leistung (5 W) für 1 Stunde und 30 Minuten, bis der Bromphenolblau-Farbstoff das Ende des Gels erreicht.
8. Schneiden Sie das Produkt der reversen Transkription aus und übertragen Sie es in nicht haftende Eppi-Röhrchen. 2 mL Röhrchen werden für die DNA-Extraktion empfohlen. Vermeiden Sie jegliche Kontamination durch nicht verlängerte RT-Primer.
9. Übernachtige Gel-Extraktion. Fügen Sie 400 μL DNA-Gel-Extraktionspuffer hinzu und frieren Sie die Probe 30 Minuten auf Trockeneis ein. Lassen Sie die Probe über Nacht (15 Stunden empfohlen) bei sanftem Mischen stehen. Sammeln Sie die gesamte Lösung und übertragen Sie sie in RNase-freie, antihaftbeschichtete Röhrchen. Fälligen Sie die Fußabdrücke, indem Sie 2 μL Glycoblue und 500 μL Isopropanol hinzufügen. Führen Sie die Fällung 30 Minuten oder länger auf Trockeneis durch. Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 Minuten mit einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie das Überstand vollständig und lassen Sie es 5 Minuten an der Luft trocknen. Lösen Sie den Fußabdruck in 15 μL von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) auf.
10. Mischen Sie 15 μL des aus dem Gel extrahierten Produkts, 2 μL CircLigase-Puffer, 1 μL von 1 mM ATP, 1 μL von 10 nM MnCl2 und 1 μL CircLigase pro Probe, inkubieren Sie die Reaktion 1 Stunde bei 60 °C und inaktivieren Sie sie 10 Minuten bei 80 °C durch Erhitzen.
11. Erholen Sie das endgültige DNA-Produkt. Fügen Sie 74 μL destilliertes Wasser, 6 μL 5 M NaCl, 2 μL Glycoblue und 150 μL Isopropanol hinzu und fällen Sie die DNA aus.
12. Resuspendieren Sie das zirkularisierte DNA-Produkt in 5 μL 10 mM Tris-HCl (pH 8,0).

Indizierte Bibliotheksgenerierung

1. PCR-Amplifikation einer zirkularisierten Bibliothek mit Phusion-Polymerase gemäß den Anweisungen des Herstellers. Führen Sie mehrere verschiedene Zyklen zum Vergleich durch. Verwenden Sie unterschiedliche Barcode-Rückwärtsprimer für verschiedene Proben mit einem einzigen Vorwärtsprimer.
2. Fügen Sie zu jedem PCR-Produkt 6× DNA-Ladefarbstoff hinzu und bereiten Sie 1 μL 10 bp DNA-Leiter als Kontrolle vor.
3. Trennen Sie die PCR-Produkte mit einem 8% Polyacrylamid-TBE-Gel für 90 Minuten bei 180 V in 0,5× TBE-Puffer oder bis der Bromphenolblau-Farbstoff zwei Drittel des Gels erreicht hat.
4. Färben Sie das Gel 3 Minuten lang in 1× SYBR Gold in 0,5× TBE-Puffer.
5. Schneiden Sie das ~175 nt PCR-Produkt aus dem Gel und schließen Sie sorgfältig das langsam wandernde, verschmierte Band (über 200 nt), Bänder von nicht verlängerten reversen Transkriptionen (~145 nt), Template und Primer (weniger als 100 nt) aus.
6. Übernachtige Gel-Extraktion. Fügen Sie 400 μL DNA-Gel-Extraktionspuffer hinzu und frieren Sie die Probe 30 Minuten auf Trockeneis ein. Lassen Sie die Probe über Nacht (15 Stunden werden empfohlen) bei sanftem Mischen stehen. Sammeln Sie die gesamte Lösung und übertragen Sie sie in RNase-freie Eppituben ohne Klebeeffekt. Fälligen Sie die Fußabdrücke, indem Sie 2 μL Glycoblue und 500 μL Isopropanol hinzufügen. Führen Sie die Fällung 30 Minuten oder länger auf Trockeneis durch. Zentrifugieren Sie bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 Minuten mit einer Tischzentrifuge. Entfernen Sie das Überstand vollständig und lassen Sie es 5 Minuten an der Luft trocknen. Lösen Sie den Fußabdruck in 15 μL von 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) auf.
7. Messen Sie die DNA-Konzentration und kombinieren Sie gleiche Mengen aus jeder Probe für die Illumina-Sequenzierung.

Sequenzierung mit Illumina-Plattformen

Dieses Protokoll führt zu einer voll funktionsfähigen Sequenzierungsbibliothek, die mit Illumina kompatibel ist. HiSeq, MiSeqund NextSeq Sequenzierungsplattformen. Der Benutzer sollte die von Illumina empfohlenen Standardverfahren zur Anpassung der endgültigen Bibliothekskonzentration für das Laden auf eine Illumina-Flusszelle und die für den verwendeten Sequenzierer geeignete Sequenzierung befolgen.

Schlussfolgerung

Ribosomen-Profiling bietet eine hochauflösende, umfassende Sicht auf die Translation, indem sie die Ribosomenstandorte auf Messenger-RNAs (mRNAs) präzise kartiert. Diese Technik dient als robustes Instrument zur quantitativen Analyse von Genexpressionsmustern, zur Entdeckung neuer translationaler Phänomene und zur Untersuchung der Dynamik der Proteinsynthese. Die einzigartige Fähigkeit von Ribosomen-Profiling Die Überwachung der Übersetzung in Echtzeit, während präzise quantitative Informationen über die Ribosomenhäufigkeit und -effektivität bereitgestellt werden, macht sie zu einem wesentlichen Werkzeug für Untersuchungen in der funktionellen Genomik, der translationalen Regulation und der Modulation der Genexpression unter verschiedenen biologischen Bedingungen.

Referenz:

1. Jin H Y, Xiao C. Eine integrierte Methode zur Polysomenprofilierung und Ribosomenprofilierung zur Untersuchung des in vivo Translatoms // Next Generation Sequencing. Humana Press, New York, NY, 2018: 1-18.