Variantenerkennung: Von Sequenzdaten zur zuverlässigen Mutationsdetektion

Variant-Erkennung ist ein entscheidender Prozess in genomisch Forschung, die die Identifizierung genetischer Unterschiede zwischen dem Genom eines Individuums und einem Referenzgenom ermöglicht. Dieser Artikel bietet einen umfassenden Überblick über die besten Praktiken für die Variantenbestimmung in der klinischen Sequenzierung, einschließlich Datenvorverarbeitung, Ausrichtung, Algorithmen zur Variantenentdeckung, Filterung und Validierung. Er erörtert auch die Herausforderungen und zukünftigen Richtungen in diesem sich schnell entwickelnden Bereich und betont die Bedeutung rigoroser Methoden und Benchmarking, um eine zuverlässige Mutationsdetektion zu gewährleisten.

Was ist Variant Calling?

Die Identifizierung genomischer Variationen stellt einen kritischen Bestandteil der Genomforschung dar, die darauf abzielt, genomische Unterschiede zwischen einzelnen Proben und Referenzsequenzen durch die Analyse von Sequenzierungsinformationen zu erkennen. Das Spektrum dieser Variationen umfasst mehrere Kategorien: Einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), Einfügungs- und Löschereignisse (Indels), größere strukturelle Umstellungen (SVs) und zusätzliche Variantenklassifikationen, die potenziell biologische Wege beeinflussen oder zur Pathogenese beitragen können.

Der Prozess der Identifizierung dieser genetischen Unterschiede hat eine erhebliche Bedeutung in genomischen Studien und erfüllt eine grundlegende Funktion in zahlreichen wissenschaftlichen und klinischen Bereichen. In der medizinischen Praxis ermöglicht die Erkennung genomischer Variationen die Identifizierung pathogener Mutationen und legt damit entscheidende Grundlagen für Krankheits-Screening-Programme, Ansätze der präzisen Medizin und genetische Beratungsdienste.

Datenvorverarbeitung und Lesenausrichtung der Variantenbestimmung

Optimierung der Qualitätskontrolle von Rohsequenzierungsdaten

Mit der allmählichen Reifung von Zweitgeneration-Sequenzierung Technologie und die kontinuierliche Erweiterung ihres Anwendungsbereichs machen es besonders wichtig, die Standards für Datenqualität, Zuverlässigkeit, Wiederholbarkeit und biologische Relevanz zu klären. Die Datenqualität spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen nachgelagerten Analysen wie der Sequenzassemblierung, der SNP-Identifizierung und Studien zur Genexpression. Daher ist es entscheidend, eine Qualitätskontrolle der Rohsequenzierungsdaten vor der Datenanalyse durchzuführen. FastQC ist ein weit verbreitetes Werkzeug zur Qualitätsbewertung, das schnell einen Qualitätsbericht für Sequenzierungsdaten erstellen kann. Es bewertet die Datenqualität aus mehreren Dimensionen, wie z.B. der Verteilung der Basisqualitäten, der Verteilung des GC-Gehalts, der Wiederholungsrate der Sequenzen usw.

Abbildung 1. FastQC-Bericht. (Von der FastQC-Website)

Nach Abschluss der Qualitätsbewertung müssen die Daten gefiltert werden. Trimmomatic (Bolger et al. 2014) und BBDuk sind gängige Filterwerkzeuge. Trimmomatic kann verschiedene Verarbeitungen an Sequenzierungsdaten durchführen, einschließlich der Entfernung von Adaptersequenzen, dem Trimmen von Niedrigqualitätsbasen usw. BBDuk verfügt ebenfalls über leistungsstarke Filterfunktionen, die Adaptersequenzen effizient identifizieren und entfernen können. Bei der Identifizierung von Adaptersequenzen vergleicht BBDuk die Sequenzierungsdaten mit bekannten Adaptersequenzen und identifiziert die Adapter genau, indem geeignete Übereinstimmungsschwellenwerte festgelegt werden. Für das Trimmen von Niedrigqualitätsbasen kann BBDuk dynamisch entsprechend dem Basisqualitätswert anpassen.

Kerntechnologien und Werkzeugauswahl für die Sequenzanpassung

Die Sequenzanpassung ist ein entscheidender Schritt bei der Variantenerkennung, der Variantenstandorte durch das Abgleichen kurzer Sequenzierungsreads mit dem Referenzgenom lokalisiert. Häufig verwendete Alignierungswerkzeuge wie BWA (basierend auf Seed-Extension, geeignet für lange Reads und komplexe Genome) und Bowtie2 (basierend auf BWT-Transformation, geeignet für kurze Reads und schnelle Anpassungen) verwenden unterschiedliche Algorithmen, um verschiedenen Anforderungen gerecht zu werden, während STAR speziell für RNA-seq-Daten entwickelt wurde und effektiv mit Splicing-Anpassungen umgehen kann.

Lokale Ausrichtung und globale Ausrichtung sind zwei verschiedene Ausrichtungsstrategien, die in unterschiedlichen Szenarien anwendbar sind. Die lokale Ausrichtung berücksichtigt nur die ähnlichen Teile der Sequenz und erfordert nicht, dass die gesamte Sequenz vollständig übereinstimmt. Sie wird häufig verwendet, um konservierte Regionen in der Sequenz zu finden oder Mutationen zu erkennen. Die globale Ausrichtung erfordert, dass die gesamte Sequenz ausgerichtet wird, was sich für den Vergleich zweier ähnlicher Sequenzen eignet. Zum Beispiel kann die lokale Ausrichtung beim Erkennen von SNPs den Mutationsort genauer finden; und beim Vergleich homologer Gene zweier Arten ist die globale Ausrichtung angemessener.

Variant-Calling-Algorithmen und -Werkzeuge

Analyse der traditionellen Wahrscheinlichkeitsmodellmethode

Eines der häufig verwendeten Werkzeuge zur Variantenentdeckung ist das HaplotypeCaller-Modul der GATK-Software. Dieses Modul schätzt die Genkombinationen verschiedener Haplotypen und berechnet die Wahrscheinlichkeiten jeder Kombination. Basierend auf diesen Wahrscheinlichkeiten wird die Methode des umgekehrten Schließens verwendet, um den Genotyp jeder Probe zu bestimmen. Das HaplotypeCaller-Modul ist nicht nur für die Variantenentdeckung in Populationen geeignet, sondern kann auch individuelle Mutationsinformationen und die Genotypverteilung basierend auf Populationsinformationen ableiten.

Bayes'sche statistische Modelle werden im GATK HaplotypeCaller häufig verwendet. Das Modell berücksichtigt mehrere Faktoren, wie die Sequierungsfehlerquote, den Basisqualitätswert usw., um die Wahrscheinlichkeit zu berechnen, dass jeder Standort ein Variantenstandort ist. Auf diese Weise kann die Echtheit der Variante genauer beurteilt und falsch-positive Ergebnisse können reduziert werden.

Abbildung 2. GATK-Arbeitsablauf. (Von der GATK-Website)

Der grundlegende Arbeitsablauf zur SNP-/Indel-Erkennung mit dem GATK-HaplotypeCaller-Modul besteht aus vier Hauptschritten:

• 1) Aktive Bereiche identifizieren

Gleiten Sie entlang des Referenzgenoms in einem bestimmten Fenster, berechnen Sie den Aktivitätswert jeder Position im Genom, indem Sie statistisch Mismatches, Indels und Softclips vergleichen, und verwenden Sie den Glättungsalgorithmus zur Verarbeitung, der dem Messen des Entropiewerts der Region entspricht. Wenn der Entropiewert einen bestimmten festgelegten Schwellenwert erreicht, wird die Region als aktive Region für die anschließende Assemblierung bestimmt.

• 2) Bestimmung von Haplotypen durch Wiederzusammenstellung aktiver Regionen

Für jede aktive Region werden die vorherigen Leseausrichtungsresultate ignoriert und die Reads in der Region werden wiederverwendet, um einen De-Bruijn-ähnlichen Graphen zu erstellen, um aktive Regionen zusammenzustellen und mögliche Haplotypen in den Daten zu identifizieren. Anschließend wird der Smith-Waterman-Algorithmus verwendet, um jeden Haplotyp mit dem Referenzhaplotyp neu auszurichten, um potenzielle Variantenstellen zu identifizieren.

• 3) Bestimmen Sie den Wahrscheinlichkeitswert des Haplotyps für jeden Lesevorgang.

Für jede aktive Region verwendet das Programm den PairHMM-Algorithmus, um jeden Read mit jedem Haplotyp abzugleichen und eine Matrix von Haplotyp-Wahrscheinlichkeitswerten zu erzeugen. Diese Wahrscheinlichkeitswerte werden dann marginalisiert, um die Allel-Wahrscheinlichkeit für jede potenzielle Variantenstelle für einen gegebenen Read zu erhalten.

• 4) Genotyp bestimmen

Die Wahrscheinlichkeitswerte der Kandidaten-Haplotypen, die im vorherigen PairHMM-Schritt erhalten wurden, werden mithilfe des Bayes'schen Algorithmus in die Wahrscheinlichkeitswerte der Genotypen an jedem Standort umgewandelt.

Neben GATK HaplotypeCaller gibt es auch Werkzeuge wie Samtools und VarScan. Samtools ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das eine Vielzahl von Operationen an Sequenzierungsdaten durchführen kann, einschließlich Sortierung, Indizierung und Variantenerkennung. Seine Vorteile sind die hohe Geschwindigkeit und die Fähigkeit, großangelegte Sequenzierungsdaten zu verarbeiten; sein Nachteil ist, dass die Genauigkeit bei der Verarbeitung komplexer Varianten relativ niedrig ist. VarScan konzentriert sich auf die Variantenerkennung in Tumormustern und kann niedrigfrequente somatische Varianten erkennen. Allerdings kann VarScan einige seltene Varianten bei der Erkennung übersehen.

Die Erkennungsrevolution, die durch Deep Learning vorangetrieben wird

Deep Learning hat eine Revolution im Bereich der Variantenerkennung ausgelöst, und DeepVariant ist ein typisches Beispiel dafür. Sein Kern ist die Architektur des Convolutional Neural Network (CNN), das automatisch charakteristische Muster in Sequenzierungsdaten lernen kann. Ein CNN besteht aus mehreren Faltungsschichten, Pooling-Schichten und vollständig verbundenen Schichten. Die Faltungsschicht schiebt den Faltungskern über die Eingabedaten, um lokale Merkmale zu extrahieren; die Pooling-Schicht reduziert die Dimension der Merkmale, um die Berechnungsmenge zu verringern; die vollständig verbundene Schicht integriert die extrahierten Merkmale und gibt die endgültigen Vorhersageergebnisse aus.

Der Fehlerkorrekturmechanismus von DeepVariant ist ein Highlight. Während des Sequenzierungsprozesses treten aufgrund verschiedener Faktoren bestimmte Fehler auf. DeepVariant kann diese Fehler effektiv identifizieren und korrigieren, indem es die charakteristischen Unterschiede zwischen normalen Sequenzierungsdaten und fehlerhaften Daten durch CNN erlernt. Zum Beispiel kann es Basenfehler, die durch Sequenzierfehler verursacht werden, identifizieren und die Genauigkeit der Variantenerkennung verbessern.

Abbildung 3. Übersicht des DeepVariant-Workflows. (Poplin, R. et al. 2018)

Filterung und Annotation der Variantenaufrufe

Bei der Variantenentdeckung ist es entscheidend, die Qualität der Variantenergebnisse zu bewerten und zu überprüfen, um falsch-positive Varianten effektiv zu entfernen und die Zuverlässigkeit der Testergebnisse zu verbessern. DP, QUAL, FS usw. sind gängige Indikatoren zur Qualitätsbewertung.

DP (Tiefe) bezieht sich auf die Sequenzierungstiefe, das heißt, die Anzahl der Male, die eine bestimmte Stelle durch Sequenzierung abgedeckt wird. Allgemein gilt: Je höher die Sequenzierungstiefe, desto höher die Genauigkeit der Variantenerkennung. Üblicherweise wird der DP-Schwellenwert auf 10-20 gesetzt, was bedeutet, dass eine bestimmte Stelle mindestens 10-20 Mal durch Sequenzierung abgedeckt sein muss, bevor sie als zuverlässige Variantenseite betrachtet wird. QUAL (Qualität) ist der Qualitätswert der Variantenseite, der umfassend Faktoren wie Sequenzierungsqualität und Ausrichtungsqualität berücksichtigt. Je höher der QUAL-Wert, desto höher die Glaubwürdigkeit der Variantenseite. Der gängige QUAL-Schwellenwert kann auf 30 gesetzt werden. FS (Fisher-Strang-Bias) wird verwendet, um zu erkennen, ob es eine Abweichung in der Verteilung der Variantenseiten auf den positiven und negativen Strängen gibt. Wenn der FS-Wert zu hoch ist, kann das bedeuten, dass die Variante durch Sequenzierungsfehler oder Ausrichtungsfehler verursacht wurde. Der FS-Schwellenwert wird in der Regel auf 20 gesetzt.

Die multidimensionale Filterstrategie kombiniert mehrere Qualitätsbewertungsindikatoren für ein umfassendes Screening. Zum Beispiel wird ein variant Standort nur dann beibehalten, wenn sein DP größer als 10, QUAL größer als 30 und FS kleiner als 20 ist. Diese Strategie kann falsche positive Varianten effektiver entfernen.

In Tumorproben ist die VAF (Variant Allele Frequency) ein wichtiger Parameter. Aufgrund der Heterogenität von Tumorzellen können in Tumorproben somatische Mutationen mit niedriger Frequenz vorhanden sein. Der VAF-Schwellenwert muss je nach spezifischer Situation angepasst werden. Allgemein kann für Tumorproben mit hoher Reinheit der VAF-Schwellenwert auf 5 % - 10 % festgelegt werden; für Tumorproben mit niedriger Reinheit muss der VAF-Schwellenwert möglicherweise auf 1 % - 5 % gesenkt werden.

Herausforderungen bei der genauen Mutationsbestimmung

Traditionelle Sequenzierungstechnologien sind anfällig für Sequenzierungsfehler und Hintergrundgeräusche bei der Erkennung von Mutationen mit geringer Häufigkeit, was zu einer Zunahme von falsch positiven und falsch negativen Ergebnissen führt. Faktoren wie Basenfehler und PCR-Amplifikationsbias während der Sequenzierung können beispielsweise die genaue Erkennung von Mutationen mit geringer Häufigkeit beeinträchtigen. Darüber hinaus kann Kontamination während der Probenverarbeitung ebenfalls falsche Mutationssignale einführen, was die Genauigkeit der Erkennung weiter verringert.

In der präzisen Detektion ist die Analyse komplexer genomischer Regionen eine sehr herausfordernde Aufgabe, wobei Tandemwiederholungen und GC-Präferenz die Hauptstörfaktoren sind. Tandemwiederholungen beziehen sich auf Regionen im Genom, in denen kurze DNA-Sequenzen mehrfach wiederholt werden. Die Sequenzen in diesen Regionen weisen eine hohe Ähnlichkeit auf, was leicht zu Sequenzierungsfehlern und Schwierigkeiten bei der Ausrichtung führen kann. Die GC-Präferenz bezieht sich auf den hohen GC-Gehalt in bestimmten Regionen des Genoms. Aufgrund der starken Wasserstoffbrückenbindungen zwischen GC-Basen können während des Sequenzierungsprozesses Amplifikationsverzerrungen und Signalabschwächungen auftreten, die die Genauigkeit der Sequenzierung beeinträchtigen.

Referenzen:

1. Bolger, A. M., Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: ein flexibler Trimmer für Illumina-Sequenzdaten. Bioinformatik(Oxford, England), 30(15), 2114–2120. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links übersetzen. Wenn Sie den Text hier eingeben, helfe ich Ihnen gerne bei der Übersetzung.
2. Koboldt D. C. (2020). Beste Praktiken für die Variantenbestimmung in der klinischen Sequenzierung. Genommedizin, 12(1), 91. Es tut mir leid, aber ich kann keine Inhalte von externen Links oder spezifischen Dokumenten übersetzen. Wenn Sie mir den Text geben, den Sie übersetzt haben möchten, helfe ich Ihnen gerne weiter.