miRNAs sind integraler Bestandteil der Regulation der Genexpression posttranskriptionell und orchestrieren vielfältige zelluläre Prozesse, die für die Entwicklung von Organismen, die Homöostase und die Krankheitsentstehung grundlegend sind. Das Aufkommen von Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat die miRNA-Forschung revolutioniert und bietet beispiellose Einblicke in die komplexe Landschaft der kleinen RNA-Expression. Ein umfassendes Wissen über ihre regulatorischen Funktionen und Expressionsmuster ist entscheidend, um ihre jeweiligen Rollen in gesundheits- und krankheitsbezogenen Zuständen zu entschlüsseln. Die miRNA-Sequenzierung, eine formidable Technik, ermöglicht eine gründliche Profilierung der miRNA-Expression und beleuchtet somit ihre funktionalen Implikationen. In diesem Diskurs präsentieren wir einen ausführlichen Überblick über den Workflow und das Protokoll der miRNA-Sequenzierung und heben jeden einzelnen Schritt im Prozess hervor.
Wie funktioniert die miRNA-Sequenzierung?
1. Probenvorbereitung
Der miRNA-Sequenzierungsprozess beginnt mit der Probenvorbereitung, bei der hochqualitative RNA aus den relevanten biologischen Proben extrahiert wird. Verschiedene Probenquellen, die von Geweben, Zellen, Bioflüssigkeiten bis hin zu Umwelproben reichen, sind für die miRNA-Sequenzierungsanalyse geeignet. Die Extraktionsmethoden für totale RNA werden sorgfältig ausgewählt, um die Erhaltung kleiner RNA-Spezies zu gewährleisten, wobei häufig verwendete Techniken die TRIzol-Extraktion oder säulenbasierte Reinigungskits umfassen. Strenge Aufmerksamkeit wird darauf verwendet, RNA-Abbau und Kontaminationsrisiken während der Handhabungs- und Verarbeitungsphasen zu minimieren.
2. RNA-Qualitätskontrolle
Nach der RNA-Extraktion werden die Qualität und Quantität der extrahierten RNA mithilfe spektrophotometrischer Methoden, wie UV-Absorption, und elektrophoretischer Techniken wie Agarose-Gelelektrophorese bewertet. Die Erhaltung der RNA-Integrität ist entscheidend für eine erfolgreiche miRNA-Sequenzierung, da degradierte RNA die Genauigkeit und Robustheit der Sequenzierungsergebnisse beeinträchtigen kann. Folglich werden strenge Kriterien angewendet, um hochwertige RNA-Proben mit erhaltenen kleinen RNA-Fraktionen für den anschließenden Bibliotheksaufbau auszuwählen.
3. Vorbereitung der kleinen RNA-Bibliothek
Der nächste Schritt im miRNA-Sequenzierung Der Workflow ist die Erstellung von kleinen RNA-Bibliotheken. Kleine RNA-Moleküle, einschließlich miRNAs, werden aus dem gesamten RNA-Pool mittels Größenauswahlmethoden angereichert, wie z.B. Gelelektrophorese oder Größenausschlusschromatographie. Die angereicherte kleine RNA-Fraktion wird dann mit Adaptern ligiert, die die reversen Transkription und Amplifikation erleichtern. Dieser Schritt führt eindeutige Barcodes oder Indizes zu einzelnen Proben ein, was eine multiplexe Sequenzierung mehrerer Proben in einem einzigen Sequenzierungslauf ermöglicht.
4. Rücktranskription und PCR-Amplifikation
Bei der Ligation wird ein miRNA-spezifischer Primer verwendet, um die an die Adapter gebundenen kleinen RNAs in komplementäre DNAs (cDNAs) umzuwandeln. An diesem Punkt wird eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eingesetzt, um die cDNA-Bibliothek zu verstärken und die für die nachfolgende Sequenzierung erforderlichen Suiten zu integrieren. Eine sorgfältige Optimierung der PCR-Bedingungen ist entscheidend, um Verzerrungen zu minimieren und die Wahrscheinlichkeit von Artefakten während der Amplifikation zu verringern, wodurch sichergestellt wird, dass die Ausrichtung der miRNA-Häufigkeit in der endgültigen Sequenzierungsbibliothek mit der ursprünglichen Probe übereinstimmt.
5. Qualitätskontrolle der Bibliothek
Nach der PCR-Amplifikation werden die Qualität und Quantität der kleinen RNA-Bibliotheken mithilfe analytischer Methoden wie Kapillarelektrophorese (z. B. Agilent Bioanalyzer) oder fluorometrischen Techniken (z. B. Qubit-Fluorometer) bewertet. Die Bewertung der Größenverteilung und Konzentration der Bibliotheken ist entscheidend, um die Einhaltung der Sequenzierungskriterien sicherzustellen. Anschließend werden Bibliotheken, die die Qualitätskontrollstandards erfolgreich erfüllen, normalisiert und zusammengeführt, um sie für die Sequenzierung vorzubereiten.
6. Sequenzierung
Die kombinierten kleinen RNA-Bibliotheken werden auf eine Next-Generation-Sequenzierungsplattform wie Illumina MiSeq, HiSeq oder NovaSeq eingeführt, um eine Sequenzierung durch Synthese durchzuführen. Während dieses Prozesses werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide sukzessive in komplementäre DNA-Stränge eingebaut, was Sequenzlesungen ergibt, die die kleine RNA-Zusammensetzung des Probenmaterials treu abbilden. Die Sequenzierungstiefe, quantifiziert durch die Anzahl der pro Probe erzeugten Reads, wird angepasst, um die gewünschte Abdeckung und Sensitivität für eine präzise miRNA-Expressionsanalyse zu gewährleisten.
7. Datenvorverarbeitung und Qualitätskontrolle
Nach der Sequenzierung wird die von dem Sequenzierer erzeugte Rohdaten einer Vorverarbeitung unterzogen, um Adaptersequenzen, niedrigqualitative Reads und Sequenzierungsartefakte zu entfernen. Qualitätskontrollparameter, wie die Sequenzqualität pro Base und die Verteilung des GC-Gehalts, werden genau überprüft, um die Datenintegrität zu gewährleisten. Die Vorverfahrensschritte können zusätzlich die Exzision von niedrigqualitativen Basen und das Aussortieren von Reads gemäß Kriterien für Länge und Sequenzzusammensetzung umfassen.
8. Ausrichtung und Zuordnung
Die vorverarbeiteten Sequenzierungsreads werden unter Verwendung spezialisierter Alignierungsalgorithmen wie Bowtie, BWA oder miRDeep2 an Referenzgenome oder miRNA-Sequenzdatenbanken ausgerichtet. In Fällen, in denen Arten gut annotierte Genome aufweisen, können die Reads direkt an genomischen Koordinaten zugeordnet werden, die den etablierten miRNAs entsprechen. Umgekehrt, wenn Referenzgenome fehlen oder unvollständig sind, können die Reads an miRNA-Sequenzdatenbanken ausgerichtet werden, um bekannte miRNAs zu identifizieren, oder es können de novo miRNA-Vorhersagemethoden angewendet werden.
9. Quantifizierung der miRNA-Expression
Bei der Kartierung der Reads werden die Expressionsniveaus der miRNAs quantifiziert, indem die Anzahl der Reads gezählt wird, die sich an jede miRNA-Sequenz anpassen. Um Abweichungen zu verringern, die aus Variationen in der Sequierungstiefe und der Bibliotheksgröße zwischen den Proben resultieren, werden Normalisierungstechniken wie Reads pro Million (RPM) oder Transkripte pro Million (TPM) eingesetzt. Die resultierenden miRNA-Expressionsprofile liefern quantitative Einblicke in die Häufigkeit einzelner miRNAs innerhalb der Proben.
10. Differenzielle Expressionsanalyse
Statistische Methoden werden eingesetzt, um unterschiedlich exprimierte miRNAs unter verschiedenen experimentellen Bedingungen oder Stichprobenkohorten zu erkennen. Die Analyse der differentiellen Expression umfasst eine vergleichende Bewertung der miRNA-Expressionsniveaus über die Proben hinweg, wobei sorgfältig Faktoren wie biologische Replikate und Nuancen des experimentellen Designs berücksichtigt werden. Signifikant dysregulierte miRNAs werden durch strenge statistische Kriterien identifiziert, die Fold-Change und angepasste p-Werte umfassen, wodurch miRNA-vermittelte regulatorische Veränderungen im Zusammenhang mit biologischen Prozessen oder pathologischen Zuständen aufgezeigt werden.
11. Funktionelle Annotation und Pfadanalyse
Die differentielle Expression von miRNAs erfordert eine gründliche Untersuchung, um ihre funktionale Bedeutung innerhalb biologischer Rahmenbedingungen, einschließlich zellulärer Signalwege und Krankheitsursachen, aufzudecken. Diese Erforschung erfordert einen facettenreichen Ansatz, der miRNA-Expressionsprofile mit modernsten bioinformatischen Ressourcen und Datenbanken integriert. Durch diese Integration führen wir Pfadanreicherungsanalysen durch, prognostizieren Zielgenkandidaten und skizzieren regulatorische Netzwerke, die durch abnormale miRNA-Expressionsmuster moduliert werden. Durch das Eintauchen in funktionale Annotationen und Pfadanalysen gewinnen wir tiefgehende Einblicke in die entscheidenden Rollen von Veränderungen in der miRNA-Expression und entschlüsseln damit ihr komplexes Engagement in der Krankheits-Pathophysiologie.
12. Validierung und experimentelle Validierung
Zusammenfassend folgt nach der Identifizierung potenzieller miRNA-Kandidaten durch Sequenzierungsanalysen eine rigorose Validierung mittels experimenteller Methoden wie quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), Northern Blotting oder funktionellen Assays. Diese Validierungsverfahren dienen dazu, die Expressionsprofile und regulatorischen Auswirkungen der identifizierten miRNA-Kandidaten zu bestätigen und somit die Ergebnisse aus miRNA-Sequenzierungsanalysen zu festigen. Eine solche experimentelle Validierung ist ein Grundpfeiler, der entscheidend ist, um die Glaubwürdigkeit und biologische Bedeutung der Ergebnisse der miRNA-Sequenzierung zu bekräftigen, während sie gleichzeitig wertvolle funktionale Erklärungen hinsichtlich der Rolle von miRNAs in verschiedenen biologischen Umgebungen liefert.
13. Dateninterpretation und biologische Erkenntnisse
Die Ergebnisse, die aus der miRNA-Sequenzierungsanalyse abgeleitet werden, unterliegen zusammen mit experimentellen Validierungsdaten einer sorgfältigen Interpretation, die darauf abzielt, die komplexen regulatorischen Funktionen von miRNAs sowohl im physiologischen Wohlbefinden als auch in pathologischen Zuständen zu erhellen. Durch einen integrativen Ansatz, bei dem die miRNA-Expressionsprofile mit verschiedenen Omics-Datensätzen, die mRNA-Expression, Proteomik und Epigenomik umfassen, harmonisiert werden, wird ein ganzheitliches Verständnis der von miRNA gesteuerten regulatorischen Netzwerke erreicht, das deren tiefgreifenden Einfluss auf zelluläre Dynamiken und Krankheitsmanifestationen beleuchtet. Dieses interpretative Bestreben fördert nicht nur die Generierung von Hypothesen und regt die Formulierung relevanter Forschungsfragen an, sondern offenbart auch potenzielle therapeutische Ziele, die einer weiteren Untersuchung und Überprüfung bedürfen.
Workflow der miRNA-Sequenzierung und Datenanalyse.
miRNA-Sequenzierungsprotokoll
In dieser Fortsetzung des miRNA-Sequenzierungs-Workflows werden wir das Protokoll näher betrachten, das die Schritte zur Vorbereitung der miRNA-Bibliothek, Sequenzierung und Datenanalyse beschreibt.
miRNA-Bibliotheksvorbereitungsprotokoll
Materialien:
Gesamt-RNA-Proben
Klein-RNA-Bibliotheksvorbereitungs-Kit (z.B., CD Small RNA Bibliotheksvorbereitungsset für Illumina)
Nukleasefreies Wasser
Adapter und Primer
RNase-Inhibitor
Reverse Transkriptase
PCR-Reagenzien (z. B. Taq-Polymerase, dNTPs, PCR-Puffer)
Verfahren:
Adapter-Ligation: Mischen Sie RNA-Proben mit 3'- und 5'-RNA-Adaptern sowie Ligase-Puffer. Inkubieren Sie die Mischung bei einer geeigneten Temperatur für die Adapterligierung.
Reverse-Transkription: Fügen Sie der ligierten RNA-Proben Reverse-Transkriptase und RNase-Inhibitor hinzu, um cDNA zu erzeugen. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei einer geeigneten Temperatur für die Reverse-Transkription.
PCR-Amplifikation: cDNA mit PCR-Primern amplifizieren, die an die Adapter annealen. PCR unter optimierten Bedingungen durchführen, um die kleine RNA-Bibliothek zu amplifizieren. Barcode-Sequenzen für das Multiplexing einfügen, falls gewünscht.
Bibliotheksbereinigung: Reinigen Sie amplifizierte Bibliotheken mithilfe von Größenfragemethoden (z. B. Gel-Elektrophorese oder magnetische Perlenreinigung), um nicht inkorporierte Adapter und Primer-Dimere zu entfernen.
Bibliotheksqualitätskontrolle: Bewerten Sie die Qualität und Quantität der Bibliothek mithilfe analytischer Techniken wie Kapillarelektrophorese oder fluorometrischer Quantifizierung. Validieren Sie die Verteilung der Bibliotheksgröße und die Konzentration, bevor Sie sie zum Sequenzieren zusammenführen.
Sequenzierungsprotokoll
Materialien:
Kleine RNA-Bibliotheken
Sequenzierungsplattform (z.B. Illumina MiSeq, HiSeq oder NovaSeq)
Sequenzierungsreagenzien (z. B. Flusszellen, Sequenzierungsprimer und Puffer)
Indexierungsreagenzien für multiplexes Sequenzieren
Verfahren:
Bibliotheksdenaturierung: Denaturieren Sie kleine RNA-Bibliotheken, um einzelsträngige DNA-Vorlagen für die Sequenzierungscluster-Generierung zu erzeugen.
Cluster-Generierung: Immobilisieren Sie denaturierte Bibliotheken auf der Oberfläche der Sequenzierungs-Flow-Zelle mittels Brückenamplifikation, um Cluster identischer DNA-Fragmente zu erzeugen.
Sequenzierung durch Synthese: Führen Sie die Sequenzierung durch Synthese mit fluoreszenzmarkierten Nukleotiden durch, um Sequenzlesungen aus den DNA-Clustern zu erzeugen. Überwachen Sie die Fluoreszenzsignale, um die Sequenz der incorporierten Nukleotide zu bestimmen.
Basisaufruf: Konvertieren Sie Fluoreszenzsignale in Nukleotidbasisaufrufe mithilfe der von der Sequenzierungsplattform bereitgestellten Sequenzierungssoftware.
Datengenerierung: Rohsequenzierungsdaten, einschließlich Sequenzlesungen und Qualitätswerte, vom Sequenzierer für die nachgelagerte Analyse sammeln.
Datenanalyseprotokoll
Bioinformatik-Pipeline:
Vorverarbeitung: Adaptersequenzen und niedrigqualitative Basen aus rohen Sequenzierungsreads entfernen. Kurze Reads (< 15 Nukleotide) und Sequenzen mit niedriger Komplexität herausfiltern.
Ausrichtung: Verarbeiten von Reads zur Zuordnung zu Referenzgenomen oder miRNA-Sequenzdatenbanken unter Verwendung von Ausrichtungsalgorithmen (z. B. Bowtie oder BWA).
Quantifizierung: Zählen Sie die Anzahl der Reads, die mit jeder miRNA-Sequenz übereinstimmen. Normalisieren Sie die Read-Zahlen, um Unterschiede in der Sequierungstiefe und der Bibliotheksgröße zu korrigieren.
Differenzielle Expressionsanalyse: Identifizieren Sie differentiell exprimierte miRNAs zwischen experimentellen Bedingungen mithilfe statistischer Methoden (z. B. DESeq2 oder edgeR).
Funktionale Annotation: Funktionale Annotation von miRNAs basierend auf der Vorhersage von Zielgenen, der Analyse der Weganreicherung und der Analyse von Regulierungsnetzwerken.
Validierung: Validieren Sie die Sequenzierungsergebnisse mithilfe experimenteller Techniken wie qRT-PCR oder funktionalen Assays, um die Expressionsmuster und regulatorischen Effekte der Kandidaten-miRNAs zu bestätigen.
Fazit
Der miRNA-Sequenzierungsworkflow bietet einen robusten Rahmen für die Profilierung der miRNA-Expression und die Aufklärung ihrer funktionalen Bedeutung in biologischen Prozessen und Krankheiten. Durch die Befolgung des oben skizzierten Protokolls können Forscher hochwertige miRNA-Sequenzierungsdaten generieren, differenzielle Expressionsmuster analysieren und Einblicke in miRNA-vermittelte regulatorische Netzwerke gewinnen. Dieser umfassende Ansatz erleichtert die Entdeckung neuer Biomarker, therapeutischer Ziele und mechanistischer Einblicke in die miRNA-Biologie und trägt zu Fortschritten in der biomedizinischen Forschung und der Präzisionsmedizin bei.
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