Nachweismethoden für die Analyse genetischer Mutationen

Als Schwerpunkt der aktuellen biowissenschaftlichen Forschung genießt die genetische Mutation schnell fortschreitende Nachweismethoden, die mit dem Bereich synonym sind. Die Fortschritte bei den Techniken zur Erkennung genetischer Mutationen haben eine bedeutende Bedeutung für die frühzeitige Diagnose und Behandlung von Krankheiten. Ziel dieses Papiers ist es, eine prägnante Darstellung der verschiedenen gängigen Methoden zur Erkennung genetischer Mutationen und ihrer zugrunde liegenden Prinzipien zu bieten. Dies soll bei der angemessenen Auswahl basierend auf den Testzielen und experimentellen Bedingungen helfen.

Southern-Blot

1975 von dem angesehenen britischen Biologen Edwin Southern entwickelt, ist die Southern-Blot-Hybridisierung eine bahnbrechende Technik zur spezifischen Detektion von DNA. Verankert im grundlegenden Prinzip der Basenkomplementarität nutzt diese Methode die präzise und selektive Hybridisierung von zwei Nukleinsäure-Einzelsträngen, die unter bestimmten Bedingungen Homologie aufweisen, was zur Bildung einer doppelsträngigen Struktur führt. Als erste Ausprägung der Blotting-Methoden hat die Southern-Blot-Hybridisierung eine wichtige Präsenz im Bereich der Molekularbiologie.

Im Kern basiert der Mechanismus der Southern-Blot-Hybridisierung auf dem Prinzip der komplementären Basenpaarung. Dieser Prozess umfasst Nukleinsäurestränge, die, mit einem gewissen Grad an Homologie, selektiv an der Bildung von doppelsträngigen Strukturen unter festgelegten Bedingungen teilnehmen. Vorausgesetzt, dass das Zielmaterial Sequenzen enthält, die komplementär zu der Sonde sind, wird ihre Interaktion durch präzise Basenpaarung ermöglicht. Nach der Entfernung ungebundener Sonden durch Waschprozesse erfolgt die Identifizierung und Quantifizierung der hybridisierten Fragmente mittels Methoden wie Autoradiographie (Abbildung 1) oder anderen geeigneten Verfahren.

Angesichts seiner überlegenen Sensitivität und Spezifität gewann die Southern-Blot-Hybridisierung schnell Anerkennung als die archetypische molekulare Nachweismethode im Spektrum der Sondenhybridisierungstechniken. Seine Anwendbarkeit erstreckt sich über zahlreiche Bereiche, wie die Abgrenzung von Genmutationen und die Untersuchung von Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP).

Abbildung 1. Southern-Blot-Analyse (Rajiv Kumar et al., 2012).

PCR

Im Bereich der Genmutationsdetektion hat die Southern-Blot-Technologie seit 1985 eine herausragende Stellung eingenommen, da sie in der Lage ist, verschiedene Mutationsformen wie Genlöschungen, Insertionen und Frameshift-Rekombinationen zu erkennen. Allerdings führte die technologische Einschränkung jener Zeit dazu, dass die Unfähigkeit, Zielgene innerhalb von Proben künstlich zu amplifizieren, bestimmte Mutationen für den Southern Blot unentdeckbar machte. Folglich erforderten Mutationen, die dem Southern Blot entgingen, eine komplexe in vitro Oligonukleotid-vermittelte DNA-Mutagenese, gefolgt von mühsamer DNA-Sequenzanalyse zur Bestätigung – eine Methode, die durch ihre Komplexität, zeitaufwendige Natur und hohe Kosten gekennzeichnet ist.

Die Einführung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Technologie heraldierte einen Paradigmenwechsel in der molekularen Diagnostik, insbesondere im Hinblick auf die Erkennung von Genmutationen. Im Wesentlichen basieren alle modernen molekularen Diagnosemethoden auf der PCR-Methodik. Die Implementierung der PCR-Technologie führte zu erheblichen Fortschritten in mehreren Dimensionen der Detektion: Sie automatisierte Verfahren, verkürzte den Analysezeitrahmen und steigerte die Präzision der Ergebnisse erheblich. In jedem Fall stellte die Integration der PCR-Technologie eine bahnbrechende Entwicklung in der Forschung zur Erkennung von Genmutationen dar.

1. ARMS-PCR

Der Amplifikationsrefraktäres Mutationssystem - Polymerase-Kettenreaktion (ARMS-PCR)auch bekannt als Allel-spezifische PCR (AS-PCR), basiert auf dem Prinzip der allelspezifischen Verlängerungsreaktion. Diese Technik erfolgt nur, wenn die Primerpaare eines spezifischen Allels mit der Mutationsstelle übereinstimmen, was die Verlängerungsreaktion ermöglicht. Weltweit hat sich ARMS-PCR als eine der kritischsten und fortschrittlichsten Technologien im Bereich der individuellen molekularen Tumorerkennung etabliert. Gleichzeitig gilt sie als eines der genauesten technologischen Instrumente im Bereich der genetischen Krankheitsdiagnose.

Die Unterscheidung zwischen ARMS-PCR und die konventionelle PCR liegt im Design des Primers für allelspezifische Gene. Zwei Upstream-Primer haben unterschiedliche 3'-Endsequenzen. Während des PCR-Amplifikationsprozesses können Upstream-Primer, die nicht vollständig mit der Vorlage übereinstimmen, keine vollständig komplementären Basenpaare bilden, was zu Fehlpaarungen führt. Sobald diese Fehlpaarung ein bestimmtes Niveau erreicht, wird die Primerverlängerung beendet, und es kann kein PCR-Amplifikationsprodukt einer spezifischen Länge erhalten werden, was darauf hinweist, dass die Template-DNA kein Basenpaar mit dem 3'-Ende des Primers hat und umgekehrt (Peng et al., 2018). Derzeit haben Wissenschaftler die ARMS-PCR-Methodik erweitert, um vier Primer zu integrieren (Tetra-Primer ARMS-PCR), wobei vier PCR-Primer gleichzeitig entworfen werden, von denen zwei am 3'-Ende der SNP-Stelle liegen und entgegengesetzte Richtungen haben, die zu unterschiedlichen Genotypen gehören, während die anderen beiden außerhalb des SNP liegen (Abbildung 2).

Abbildung 2 ARMS-PCR (Ye et al., 2001)

2. Digitale PCR

Die digitale PCR (dPCR) verkörpert eine fortschrittliche Technik zur absoluten Quantifizierung von Nukleinsäuren. Sie wird als die dritte Generation der PCR-Technologien gefeiert und gilt als wegweisend im Bereich der Lebenswissenschaften und klinischen Diagnostik. Dieses Konzept wurde erstmals 1999 von den Luminarien Bert Vogelstein und Kenneth W. Kinzler ins Licht gerückt.

Die digitale PCR ist ein einzigartiges System, das die Proben in Tröpfchen mikropartitioniert und dabei sicherstellt, dass sich im Durchschnitt ein oder null Ziel-DNA-Moleküle in jeder Partition befinden. Nach der PCR-Amplifikation wird das Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz in diskreten Partitionen mithilfe eines binären Systems aufgezeichnet. In diesem System wird das Vorhandensein von Fluoreszenz als 1 und das Fehlen von Fluoreszenz als 0 bezeichnet. Die anschließende statistische Analyse der Fluoreszenzsignale ermöglicht eine genaue absolute Quantifizierung von Wildtyp- und Mutantenarten innerhalb der Testprobe. Dieses hohe Maß an Sensitivität erlaubt die Erkennung von Mutationen bereits bei einer einzelnen Kopie. (Abbildung 3)

Abbildung 3 dPCR-Workflow (Cao et al., 2020)

3. HRM

Die Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM), erfunden von Professor Carl Wittwer der Molekularpathologie an der Universität Utah, ist ein technologischer Fortschritt, der auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basiert; sie wurde speziell zur Erkennung von Genmutationen und zur Genotypisierung entwickelt. HRM beruht hauptsächlich auf einem System, das PCR-Zielfragmente kombiniert, die für den jeweiligen Zweck geeignet sind, einem sättigenden fluoreszierenden Farbstoff für DNA-Doppelstränge, einem Instrumentensystem, das in der Lage ist, thermisch regulierte Hochauflösungs-Schmelzkurvensignale zu erfassen, und einem Software-Analyse-System für Schmelzkurven. Aufgrund ihrer Einfachheit, Kosteneffizienz, Schnelligkeit, des geschlossenen Röhrenmodus nach der PCR, der das Risiko einer sekundären Kontamination verringert, und der hohen Nachweisempfindlichkeit hat sich die Technik schnell für verschiedene Genanalysen in medizinischen und anderen biowissenschaftlichen Bereichen etabliert.

Das Hauptprinzip des HRM nutzt die Eigenschaft eines sättigenden Typs von doppelsträngiger DNA (dsDNA) Farbstoffen, die in das PCR-Produkt integriert werden können. Es umfasst die Echtzeitüberwachung des Entwindens von dsDNA während des Heizprozesses, die anschließenden Ablösungen des fluoreszierenden Farbstoffs, die zu einer Reduktion oder vollständigen Abwesenheit von fluoreszierenden Signalen führen, und die präzise Aufzeichnung der Schmelzkurve in hoher Auflösung. Dadurch wird eine hochsensible Analyse von Mutationen in Proben ermöglicht. einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), und Methylierungsstellen bei der Auflösung einer einzelnen Base.

Abbildung 4 HRM-Prinzip (Nguyen-Dumont et al., 2011)

Die Einschränkungen der HRM-Technologie, ähnlich wie bei anderen Methoden zur Erkennung von Genmutationen, umfassen Schwierigkeiten bei der Identifizierung unbekannter Mutationsstellen und die Sensitivität, die durch die Art der Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) im untersuchten genetischen Segment beeinflusst wird. Dennoch bietet die HRM-Technologie, ähnlich wie andere Gentestmethoden, die spezifische Genfragmente anvisieren, mehrere Vorteile, darunter Flexibilität, Geschwindigkeit, hohe Sensitivität und Kosteneffizienz. Darüber hinaus hat sie die Fähigkeit, alle Arten von Genmutationen zu erkennen. Sie bietet auch die Anpassungsfähigkeit, den Testdurchsatz zu erhöhen, was die Menge der verwendeten Proben spart, die Testzeit und -kosten reduziert und das Risiko einer Kontamination minimal erhöht – eine optimale Lösung, um den Anforderungen klinischer Tests gerecht zu werden.

4. IAT

Die isotherme Amplifikationstechnologie (IAT) ist eine weitere Methode, die aus der traditionellen PCR hervorgegangen ist. Sie arbeitet bei konstanter Temperatur, um DNA zu amplifizieren, was sie äußerst schnell, sensitiv, unkompliziert, tragbar und hochspezifisch macht. IAT hat ein herausragendes Anwendungspotenzial in der molekularen Diagnostik, insbesondere bei Tests vor Ort und bei der Screening vor Ort. Das grundlegende Prinzip der IAT besteht darin, verschiedene Enzyme wie strand-displacing Polymerasen, RNA-Spleißosomen usw. zu verwenden, um die DNA-Amplifikation unter isothermen Bedingungen basierend auf einem zirkulären DNA-Amplifikationsschema abzuschließen. Während der IAT kann ein geeigneter Primer-Design unterschiedliche Längen von RNA-Fragmenten durch die Funktion eines RNA-Spleißosoms erzeugen. Die Detektion dieser RNA-Fragmente erleichtert die Analyse spezifischer Mutationen innerhalb der DNA-Sequenz.

Abbildung 5 PCR und einige IAT-Systeme (Boonbanjong et al., 2022)

Mit dem kontinuierlichen Fortschritt biotechnologischer Methoden haben IAT eine Vielzahl von Techniken hervorgebracht. Dazu gehören die Loop-vermittelte isotherme Amplifikation (LAMP), die Rolling Circle Amplifikation (RCA), die nucleinsäuresequenzbasierte Amplifikation (NASBA), die helicaseabhängige isotherme DNA-Amplifikation (HDA), die Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA), die Nicking-Enzym-Amplifikationsreaktion (NEAR), die Strand-Displacement-Amplifikation (SDA) und die Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR).

Genomsequenzierung

Die Essenz der Gen-Sequenzierung besteht darin, einen Gen-Sequenzierer zu verwenden, um die Anordnung der vier Nukleobasen (Adenin [A], Thymin [T], Guanin [G] und Cytosin [C]) in einem Gen zu bestimmen. Das zugrunde liegende Prinzip besteht darin, die vier Arten von Basen im Gen mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben zu kennzeichnen. Innerhalb des Gen-Sequenzierers aktiviert ein Lasersystem die Basen in ihrer angeordneten Reihenfolge, wobei jeder Basentyp eine einzigartige Fluoreszenzfarbe erzeugt. Spezielle Kameras erfassen diese fluoreszierenden Signale, die schließlich die Nukleotidsequenz im Gen aufklären.

Die Fortschritte in Wissenschaft und Technologie haben die Genomsequenzierungstechniken schrittweise verfeinert, beginnend mit dem, was wir heute als Sanger-Sequenzierung zum Zeitgenössischen Next-Generation Sequencing (NGS) und Langzeit-Sequenzierung Techniken.

Sanger-Sequenzierung

Im Jahr 1977 heraldeten die Ankünfte der Dideoxy-Kettenabbruchmethode, die von Sanger vorgeschlagen wurde, und der chemischen Abbaumethode, die von Gilbert vorgeschlagen wurde, die Geburt der Sequenzierungstechnologie der ersten Generation. Unter ihnen ist die Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger (Sanger-Sequenzierung) die klassischste und eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Erkennung von Genmutationen in der Sanger-Sequenzierungstechnologie. Inzwischen wurde die chemische Abbaumethode schrittweise ausgemustert. Die Sanger-Sequenzierung zielt auf den spezifischen Bereich der Template-DNA durch spezifische Primer ab und integriert Dideoxy-Nukleotide (ddNTP) in die PCR-Reaktion, trennt die Verlängerungsprodukte durch Elektrophorese und detektiert fluoreszierende Marker, um so die Baseninformation an jeder Position zu erhalten und folglich spezifische Mutationen in der DNA-Sequenz zu identifizieren (Abb. 6). Als der "Goldstandard" der Sequenzierung gilt die Sanger-Sequenzierung, die eine höhere Sequenziergenauigkeit als NGS und TGS aufweist. Darüber hinaus bietet sie eine verfeinerte Genauigkeit für Leseweiten von 700-1000 bp und kann sich geschickt mit repetitiven Sequenzen auseinandersetzen. Ihre Hauptbeschränkungen sind jedoch, dass sie nur ein Template gleichzeitig untersuchen kann und vergleichsweise langsamer und zeitaufwändiger ist (Zhang et al., 2021).

Abbildung 6 Sanger-Sequenzierungsprozess (Zhang et al., 2021)

2. NGS

Die Next-Generation-Sequencing (NGS) basiert auf PCR-Technologie und der Grundlage von Genchips und verwendet Hochdurchsatz-Parallelsequenzierungstechnologie. Sie ermöglicht die gleichzeitige Synthese von Millionen sequenzierter, komplementärer Stränge und sammelt Sequenzdaten. NGS verwendet hauptsächlich die Technologien Sequencing-by-Synthesis (SBS) und Sequencing-by-Ligation (SBL). Derzeit sind Illumina-Sequenzierungssysteme das Hauptprodukt im Bereich NGS. NGS bestimmt die DNA-Sequenz, indem es das spezielle Tag erfasst, das von den neu hinzugefügten Basen während des DNA-Replikationsprozesses getragen wird, welches oft ein fluoreszierender molekularer Marker ist. Der gesamte Prozess kann in vier Hauptschritte unterteilt werden: Bibliotheksvorbereitung, DNA-Cluster-Generierung, Sequencing-by-Synthesis und Datenanalyse. Zwei wichtige Merkmale von NGS sind der hohe Durchsatz und die kurze Lese-Länge. Ihre Effizienz und die niedrigen Kosten pro Base bieten unschätzbare Vorteile für klinische Anwendungen.

3. Langzeit-Sequenzierung

Langzeit-Sequenzierung stellt einen Meilenstein im Bereich der Sequenzierungstechnologie dar. Diese aufkommende Technologie, die auf der Einzelmolekülsequenzierung (SMS) und der massiven Parallelsequenzierung basiert, verzichtet auf die Notwendigkeit der PCR-Amplifikation von DNA-Molekülen während der Sequenzierung. Sie beruht auf der Untersuchung einzelner elektrischer oder chemischer Reaktionssignale, die auf einem einzelnen Molekül basieren, und ermöglicht so die separate Sequenzierung jedes DNA-Moleküls. Während PacBio-Technologie und Nanopore-Technologie In der Langzeit-Sequenzierung, einem Beispiel für diese Technologie, werden Nanopore-Proteine an einer widerstandsfähigen Membran befestigt. Wenn Nukleinsäuren durch das Nanopore gelangen, gibt es Veränderungen in der elektrischen Ladung. Da der Durchmesser der Nanoporen extrem klein ist und nur einen einzelnen Nukleinsäurepolymer gleichzeitig durchlässt, beeinflussen verschiedene Basen den Strom auf charakteristische Weise, während sie durch das Protein-Nanopore hindurchgehen. Die Echtzeitüberwachung und Dekodierung dieser Stromsignale bestimmen dann die Basensequenzen. Die Langzeit-Sequenzierung kann aufgrund ihrer längeren Sequenzierleselänge originale DNA-Proben direkt sequenzieren, RNA- und methyliertes DNA-Sequenzen direkt nachweisen und hat den Vorteil einer schnellen Durchführung.

Hybridisierung

1. FISCH

Im Jahr 1986 begannen Forscher, Fluorescein-Isothiocyanat zur Kennzeichnung von Sonden zu verwenden, die anschließend unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert wurden, wodurch die Technik der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) etabliert wurde. In diesem Prozess paaren sich exogene Nukleinsäuren (häufig als molekulare Sonden bezeichnet) mit Ziel-DNA oder RNA in Zellen oder Geweben gemäß dem Prinzip der Basenkomplementarität und bilden Nukleinsäure-Hybridmoleküle. Die Sonden sind typischerweise mit einem Berichtsmolekül, wie Biotin oder Digoxin, an einem spezifischen Nukleotid markiert. Dieses Label löst eine chemische Reaktion mit fluoresceinmarkierten spezifischen Affinitätsstoffen aus, die es ermöglicht, die Signalsonden unter einem Fluoreszenzmikroskop zu erfassen. Folglich wird es möglich, festzustellen, ob die Zielproben genetische Mutationen durchlaufen haben.

2. Gen-Mikroarray

Die Gen-Mikroarray-Technologie, die seit Mitte der 1990er Jahre eine rasante Entwicklung erfahren hat, steht als fortschrittliche molekularbiologische Technik an der Schnittstelle interdisziplinärer Synthese. Sie wird hauptsächlich in der Krankheitsdiagnose und -behandlung sowie in der pharmazeutischen Forschung angewendet und hat sich zu einer entscheidenden Kraft in der zeitgenössischen biomedizinischen Forschung entwickelt. Das grundlegende Prinzip, das dieser Technologie zugrunde liegt, besteht in der Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen durch die Hybridisierung von fluoreszenzmarkierten Nukleinsäuresequenzen, wobei eine Reihe bekannter Sequenzen als Sonden auf einem festen Substrat fixiert sind. Konkret, wenn eine Lösung eine fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuresequenz, wie TATGCAATCTAG, enthält und diese eine komplementäre Übereinstimmung mit der entsprechenden Nukleinsäuresonde aufweist, die an einer bestimmten Stelle auf dem Gen-Mikroarray immobilisiert ist, liefert die Sonde mit der stärksten Fluoreszenzintensität Informationen über die Sequenzkomplementarität.

Referenzen:

1. Athanasopoulou K, Boti M A, Adamopoulos P G, et al. Sequenzierung der dritten Generation: der Vorreiter für die radikale Transformation der modernen Genomik. Leben, 2021, 12(1): 30.
2. Boonbanjong P, Treerattrakoon K, Waiwinya W, et al. Isothermale Amplifikationstechnologie zur Krankheitsdiagnose. Biosensoren, 2022, 12(9): 677.
3. Cao Y, Yu M, Dong G, et al. Digitale PCR als aufkommendes Werkzeug zur Überwachung der mikrobiellen Biodegradation. Moleküle, 2020, 25(3): 706.
4. Nguyen-Dumont T, Jordheim L P, Michelon J, et al. Nachweis differenzieller allelischer Expression mittels Hochauflösungs-Schmelzkurvenanalyse: Anwendung auf das Brustkrebsanfälligkeitsgens CHEK2. BMC Medizinische Genomik, 2011, 4: 1-10.
5. Peng B, Wang Q, Luo Y, et al. Eine neuartige und schnelle PCR-basierte Methode zur Genotypisierung von Mäusen mit einer Mutation im Leptinrezeptor (db/db Mäuse). Acta Pharmacologica Sinica, 2018, 39(1): 117-123.
6. Ye S, Dhillon S, Ke X, et al. Ein effizientes Verfahren zur Genotypisierung von Einzelne Nukleotid-Polymorphismen. Nukleinsäureforschung, 2001, 29(17): e88-e88.
7. Zhang L, Chen F X, Zeng Z, et al. Fortschritte in der Metagenomik und deren Anwendung bei Umweltmikroorganismen. Grenzen der Mikrobiologie, 2021, 12: 766364.