Tiefe Sequenzierung

Was ist Deep Sequencing?

Deep Sequencing umfasst die sorgfältige Analyse von genomischen Regionen durch wiederholtes Sequenzieren, oft über Hunderte oder sogar Tausende von Iterationen hinweg. Diese hochmoderne Next-Generation-Sequenzierung Der (NGS)-Ansatz ermöglicht es Forschern, äußerst seltene Klonarten, Zellen oder mikrobielle Entitäten aufzudecken, selbst wenn sie nur 1 % der ursprünglichen Probe ausmachen.

Durch den Einsatz sowohl kurzer als auch langer Leselängen, tiefe Sequenzierung ermöglicht die Erkennung von schwer fassbaren Zellpopulationen, die in der Krebs- und Mikrobiologieforschung sowie in anderen Bereichen von entscheidender Bedeutung sind. Ihre Nützlichkeit erstreckt sich auf die Unterscheidung von winzigen Variationen innerhalb von Tumoren, eine Aufgabe, die durch das häufige Auftreten von Kontaminationen durch normale Zellen in Krebsproben und die Anwesenheit verschiedener Krebszell-Subklone innerhalb des Tumors selbst kompliziert wird.

Was ist Sequenzierungstiefe?

Nach dem Aufkommen von tiefe Sequenzierung Nach PCR und der ersten Generation von Sequenzierung hat sich die genetische Testung in eine Phase entwickelt, die durch die weit verbreitete Einführung von NGS gekennzeichnet ist. In diesem Kontext tritt die Sequierungstiefe als entscheidende Kennzahl hervor, die die Spezifität und Sensitivität der tiefen Sequenzierung anzeigt. Aber was genau ist Sequierungstiefe? Fachlich ausgedrückt bezeichnet die Sequierungstiefe das Verhältnis der gesamten Basen (bp), die die Zielregion abdecken, zur Größe des Zielgenoms. Einfacher gesagt, stellt sie die Häufigkeit dar, mit der die Basen des Zielgens iterativ interpretiert werden. Analog kann die iterative Interpretation von Basen während der tiefen Sequenzierung mit der Verfeinerung einer sich wiederholenden Aufgabe verglichen werden, bei der eine erhöhte Wiederholung mit größerer Geschicklichkeit korreliert. Folglich beeinträchtigt eine unzureichende Sequierungstiefe die Genauigkeit erheblich.

Was ist Sequenzierungsabdeckung?

Die Sequenzierungsabdeckung beschreibt hingegen den Anteil der sequenzierten Basen im Verhältnis zur gesamten Genomgröße. Standardprotokolle für die Genomsequenzierung empfehlen typischerweise eine durchschnittliche Abdeckungstiefe von 30×. Diese Empfehlung basiert auf der Beobachtung, dass bei dieser Tiefe der Anteil der >4× Abdeckung 99,21 % übersteigt, was auf eine Annäherung an die Sättigung hindeutet. Darüber hinaus ist zu diesem Zeitpunkt die Anzahl der heterozygoten Einzelne Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) tendiert dazu, ein Plateau zu erreichen. Forschungen zeigen, dass eine Sequenzierung mit einer durchschnittlichen Tiefe von 15× bei reinen SNPs eine Sättigung erreicht, während eine Abdeckung von 30× für heterozygote SNPs ausreicht.

Ist eine höhere Sequenzierungstiefe immer vorzuziehen?

In Hochdurchsatz-TiefensequenzierungDie Sequenzierungstiefe hat direkten Einfluss auf die Genauigkeit jeder Base. Bei der Analyse eines homogenen Probenmaterials, in dem jede Base nur in einer Form vorkommt, ist eine übermäßig hohe Sequenzierungstiefe möglicherweise nicht entscheidend für optimale Ergebnisse. Im Gegensatz dazu kann bei heterogenen Proben das Beibehalten derselben Sequenzierungstiefe dazu führen, dass weniger Genom-Lese-Längen die selteneren Zellen abdecken.

In Anbetracht der Auswirkungen der Sequenzierungstiefe auf die Genauigkeit genetischer Tests könnte man für eine höhere Anforderung an die Sequenzierungstiefe plädieren. Analog dazu können wir Parallelen zu unserem täglichen Leben ziehen: So wie die Größe unseres Wohnraums unser Komfortniveau beeinflusst, ist auch der Preis ein entscheidender Faktor. Daher streben wir ein optimales Gleichgewicht innerhalb unseres Budgets an. Ähnlich verbessert eine Erhöhung der Sequenzierungstiefe innerhalb eines bestimmten Rahmens die Genauigkeit des Tests. Eine unbegrenzte Erhöhung der Sequenzierungstiefe führt jedoch zu abnehmenden Erträgen: Während die Kosten in die Höhe schnellen, werden die Verbesserungen in der Genauigkeit marginal.

Wie man die Sequenzierungstiefe bestimmt

Die Wahl der geeigneten Sequenzierungstiefe hängt von verschiedenen Faktoren ab. In der Krebsforschung beispielsweise steigt die erforderliche Sequenzierungstiefe für Tumoren mit niedriger Reinheit, hoher Polykolonität und Anwendungen, die eine erhöhte Sensitivität erfordern, wie die Identifizierung von Niedrigfrequenzklonen. Typischerweise liegen die Sequenzierungstiefen in der Krebsforschung zwischen 80x und mehreren Tausend. Daher wird aus einer kosteneffektiven Perspektive bei routinemäßigen genetischen Tests zur Unterstützung der patientenorientierten Therapie das optimale Tiefenmaß priorisiert, während sehr hohe Sequenzierungstiefen für spezifische Szenarien reserviert werden.

Für NGS-Tests von Tumorgewebeproben sollte die effektive Sequierungstiefe 500x überschreiten, während sie bei Plasma-freien DNA-Proben 1000x übersteigen sollte.

Die Sequenzierungstiefe und -abdeckung bestimmen teilweise das Vertrauensniveau, das mit identifizierten Varianten an bestimmten Basenpositionen verbunden ist. Eine höhere Tiefe und Abdeckung bedeuten mehr Reads, die jede Base abdecken, wodurch das Vertrauen in die Basenaufrufe gestärkt wird.

Die empfohlenen Tiefen variieren je nach Sequenzierungsmethode:

• Whole-Genome-Sequenzierung (WGS): Typischerweise 30× bis 50×, abhängig von der Anwendung und dem statistischen Modell.
• Whole Exome-SequenzierungDie empfohlene Tiefe liegt bei etwa 100×.
• RNA-SequenzierungDie Erkennung selten exprimierter Gene erfordert eine höhere Abdeckung und Tiefe.
• ChIP-SeqDie empfohlene Tiefe liegt bei etwa 100×.

Tiefe Sequenzierungstechnologie für Onkologie

Tumorproben in der Onkologieforschung stellen eine komplexe Landschaft dar, die oft eine Mischung aus normalen Zellen und mehreren Subklonen von Tumorzellen umfasst. Um diese Komplexität zu bewältigen, ist ein nuanciertes Verständnis der Sequenzierungstiefe und ihrer entscheidenden Rolle zur Verbesserung der Genauigkeit und Sensitivität von Tests erforderlich.

Überlegungen zur erhöhten Sequenzierungstiefe:

• Tumorreinheit: Das Vorhandensein von normalen Zellen in Tumorproben stellt eine Herausforderung für die genaue Mutationsdetektion dar. Tumoren mit 50% normalen Zellen erfordern eine Verdopplung der Sequenzierungstiefe, um das gleiche Vertrauensniveau wie Proben ohne normales Gewebe zu erreichen.
• Tumorheterogenität: Polykloonalität ist ein Merkmal fortgeschrittener Tumoren, das die Notwendigkeit einer tiefergehenden Sequenzierung unterstreicht, um die Vielfalt der vorhandenen Klonarten zu erfassen. Die Tiefe der Sequenzierung muss mit der Komplexität der klonalen Architektur des Tumors übereinstimmen, um eine umfassende Variantenerkennung zu gewährleisten.
• Erforderliche Sensitivität: Die Enthüllung seltener Klone, die insbesondere nur 1% des ursprünglichen Tumors ausmachen, ist entscheidend für das Verständnis der Mechanismen von Arzneimittelresistenz und Krankheitsprogression. Um dieses Maß an Sensitivität zu erreichen, sind Sequenzierungstiefen erforderlich, die deutlich über den herkömmlichen Standards liegen und oft 100-fache Abdeckung überschreiten.

Durch die sorgfältige Berücksichtigung dieser Faktoren, Deep-Sequenzierungstechnologie erhöht die Sensitivität und Präzision onkologischer Tests und ermöglicht es Forschern, wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie und Mechanismen der therapeutischen Resistenz zu gewinnen.

Ultra-tiefe Sequenzierungsdaten aus einer Studie zur Flüssigbiopsie, die die analytische Validität demonstriert. (Gong et al., 2022)

Tiefe Sequenzierungstechnologie in der Virologie

• Influenza-Virus

Um potenzielle Krankheitserreger und deren Wechselwirkungen bei Patienten mit Influenza-A-Viren zu untersuchen, führten Kuroda M et al. eine umfassende Analyse durch. Sie extrahierten totale RNA aus den Lungen von Patienten, die an viraler Pneumonie durch H1N1 verstorben waren, synthetisierten cDNA und führten durch de novo SequenzierungDie Studie ergab, dass über 98 % der Sequenzen zum menschlichen Genom gehörten, während die H1N1-Viren- und bakteriellen Sequenzen jeweils 0,850 % und 0,005 % ausmachten.

Darüber hinaus enthüllte die Studie zwei Aminosäure-Quasi-Spezies-Phänomene an spezifischen Stellen der Hämagglutinin-Antigene des H1N1-Virus, Sa und Ca, die durch fluoreszenzquantitative PCR bestätigt wurden. Darüber hinaus unterstrich die Identifizierung eines beispiellosen bakteriellen Sensoragents und einer histologisch nicht beobachteten bakteriellen Infektion die Bedeutung der Ergebnisse.

Diese Entdeckungen werfen Licht auf zuvor nicht erkannte bakterielle Infektionen und deuten auf einen breiteren Beitrag potenzieller Krankheitserreger hin, einschließlich Streptococcus pneumoniae, zu der verschärften Morbidität und Mortalität, die mit Influenza-A-Virusinfektionen verbunden ist. Folglich kam es zur weitverbreiteten Einführung von Deep Sequencing als schnellem und kostengünstigem Werkzeug zur Pathogenerkennung.

• Anwendung in der Erkennung unbekannter Viren

Rotavirus ist eine der Hauptursachen für akute Gastroenteritis bei Säuglingen weltweit, wobei die Impfung eine entscheidende Präventionsmaßnahme darstellt. Die Qualitätskontrolle von Impfstoffen erfordert die Erkennung exogener Faktoren, die entscheidende Indikatoren für die Sicherheit des Impfstoffs sind. Im Jahr 2010, Deep-Sequenzierungstechnologie erleichterte die Erkennung des porzinen Circovirus.

Diese Entdeckung stellte ein bedeutendes Ereignis in der Regulierung der Impfstoffsicherheit dar, ähnlich dem Vorfall mit der Intussuszeption, und unterstrich die unverzichtbare Rolle der tiefen Sequenzierung zum Schutz der öffentlichen Gesundheit.

• Anwendung in Pflanzenviren

Next-Generation-Sequenzierung (NGS) hat sich als Grundpfeiler bei der Identifizierung unbekannter Krankheitserreger in verschiedenen Pflanzenarten etabliert. Zum Beispiel nutzten Li et al. NGS, um kleine RNAs aus Tomatenproben mit unterschiedlichen Symptomen zu analysieren. Durch die Anreicherung und Assemblierung von virusabgeleiteten kleinen interferierenden RNAs (vsiRNAs) identifizierten sie eine vollständige Genomsequenz des Kartoffelspindeltuber-Viroid (PSTVd) und bestätigten das Vorhandensein von zwei Stämmen des Pepino-Mosaikvirus (PepMV) in den Proben aus den Vereinigten Staaten. Darüber hinaus wurden neuartige PepMV-Stämme in mexikanischen Proben entdeckt, was die Nützlichkeit von tiefe Sequenzierung bei der Entdeckung neuer Pflanzenviren und -stämme.

Referenz:

1. Gong, B., Deveson, I.W., Mercer, T. u. a.Ultra-tiefe Sequenzierungsdaten aus einer Flüssigbiopsie-Probenstudie, die die analytische Validität demonstrieren. Sci-Daten 9, 170 (2022).