Hochdurchsatz-Sequenzierung: Definition, Technologie, Vorteile, Anwendung und Arbeitsablauf

Was ist Hochdurchsatz-Sequenzierung?

Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS), umgangssprachlich als Next-Generation Sequencing (NGS) verkörpert den bahnbrechenden technologischen Fortschritt, der die Disziplin der Genomik revolutioniert. Dieser innovative Ansatz ermöglicht es Forschern, DNA- und RNA-Moleküle schnell und in einem beispiellosen Umfang zu sequenzieren. Dies steht im krassen Gegensatz zur traditionellen Sanger-Sequenzierung, die auf der Kettenabbruchmethode basiert und durch ihre geringe Durchsatzrate und hohen Kosten erheblich eingeschränkt ist.

In Anbetracht dessen, Hochdurchsatz-Sequenzierung Methoden nutzen das Potenzial der parallelen Verarbeitung, die in der Lage ist, Millionen von DNA-Fragmenten gleichzeitig zu verwalten. Dies fördert eine schnelle, kostengünstige Sequenzierung ganzer Genome oder Transkriptome.

Solche HTS-Plattformen nutzen eine Reihe von Sequenzierungs- durch Synthese- oder Sequenzierungs- durch Ligationstechniken zur Aufklärung von DNA- oder RNA-Sequenzen. Zentral für diese Techniken ist das Zerlegen von DNA- oder RNA-Molekülen in kleine Fragmente, an die anschließend Adapter oder Primer angeheftet werden. Diese Fragmente werden amplifiziert, was in der Erzeugung von Clustern aus homologen Sequenzen auf einer festen Trägerstruktur gipfelt.

Das Sequenzierungsverfahren umfasst die iterative Bestimmung der Nukleotidsequenz innerhalb jedes Clusters, die durch die Erkennung der Integration von lumineszenzmarkierten Nukleotiden oder der Spaltung von lumineszenten Markern erreicht wird.

Vorteile der Hochdurchsatz-Sequenzierung

Präzision und Genauigkeit

Die herausragende Präzision und Genauigkeit von HTS übertreffen die herkömmlicher Sequenzierungsmethoden. Sie bieten Sequenzierungsdaten von einwandfreier Qualität und minimalen Fehlern, wodurch Forscher mit hochzuverlässigen Ergebnissen ausgestattet werden. Diese Präzision gewinnt in Bereichen wie der Variantenbestimmung und der Mutationsdetektion entscheidende Bedeutung, wo die exakte Erkennung genetischer Veränderungen unerlässlich ist, um Krankheitsprozesse zu entschlüsseln und maßgeschneiderte Therapien zu entwickeln.

Skalierbarkeit

Die Skalierbarkeitsfunktion von HTS ermöglicht die Sequenzierung großer DNA- oder RNA-Mengen innerhalb eines einzigen experimentellen Setups. Dieses Merkmal ist entscheidend für Projekte, die eine umfassende Sequenzierungsabdeckung erfordern, einschließlich umfassender Genomsequenzierung oder komplex transkriptomisch Studien, die verwenden RNA-SeqDurch den Einsatz einer hohen Proben-Durchsatzrate ermöglicht HTS eine umfassende Analyse genetischer Heterogenität, die Profilierung der Genexpression und regulatorische Netzwerke in einer Vielzahl biologischer Systeme.

Geschwindigkeit und Effizienz

Darüber hinaus bietet HTS einen erheblichen Vorteil in Bezug auf Geschwindigkeit und Effizienz im Vergleich zu traditionellen Sequenzierungstechniken. Mit der Fähigkeit, riesige Mengen an Sequenzierungsdaten in einem Bruchteil der üblichen Zeit zu erzeugen, ermöglicht es Forschern, Experimente zu beschleunigen und die Generierung wissenschaftlicher Erkenntnisse zu beschleunigen. Dies hat sich wiederum als transformativ in der klinischen Diagnostik erwiesen, wo eine schnelle Mutationsdetektion für das Management von Krankheiten unerlässlich ist.

Vielseitigkeit

HTS-Techniken sind mit einem hohen Maß an Vielseitigkeit ausgestattet und sind auf ein breites Spektrum von genomischen und transkriptomisch Analysen. Ihre Anwendung reicht von der gesamten Genom- und Exomsequenzierung bis hin zu ChIP-seq und RNA-Seq Studien. Diese umfassende Anwendung von HTS-Techniken hat bahnbrechende Fortschritte in mehreren Disziplinen wie der Krebsgenomik, der Entwicklungsbiologie und der Mikrobiologie angestoßen und bereichert somit unser Verständnis des Lebens auf molekularer Ebene.

Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie

Illumina-Sequenzierung: Ein Grundpfeiler der HTS

Illumina-Sequenzierung, eine bahnbrechende Technologie in Hochdurchsatz-Sequenzierunghat das Gebiet der genomischen Forschung erheblich vorangetrieben, dank seiner unübertroffenen Skalierbarkeit, Präzision und Kosteneffizienz. Diese Hochleistungs-Technik, formal als 'Sequenzierung durch Synthese' bezeichnet, umfasst die Fragmentierung von DNA-Proben, die Hinzufügung von Sequenzierungsadaptern und deren anschließende Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Nach Abschluss werden diese augmentierten Fragmente gleichzeitig in massiv paralleler Weise sequenziert, wobei jede integrierte Base durch entsprechende fluoreszierende Signale detektiert wird. Bemerkenswerterweise besitzen Illumina-Sequenzer die Fähigkeit, Millionen dieser DNA-Fragmente gleichzeitig zu sequenzieren, wodurch sie ein ideales Werkzeug für verschiedene Anwendungen wie die Ganzgenomsequenzierung, Exomsequenzierung und die Sequenzanalyse von RNA oder RNA-seq darstellen.

Angesichts seiner bemerkenswerten Zuverlässigkeit und Flexibilität hat sich das Illumina-Sequenzieren als die bevorzugte Technik in einem breiten Spektrum genomischer Studien etabliert, die von grundlegender Forschung bis hin zu klinischen Diagnosen reichen. Folglich hat diese Methode die Landschaft der Genomik grundlegend verändert und birgt weiterhin großes Potenzial für die Realisierung der Präzisionsmedizin.

Illumina-Sequenzierungsprozess (Lu Zhang et al., 2021)

Oxford Nanopore-Sequenzierung: Echtzeit- und Langlesefähigkeiten

Im Gegensatz dazu, Oxford Nanopore-Sequenzierung verursacht einen Paradigmenwechsel, indem es Echtzeit-Sequenzierungsfähigkeiten mit erweiterten Lese-längen anbietet und somit die Dynamik der Genomforschung neu gestaltet. Diese zeitgemäße Methode basiert auf der Annahme, dass DNA- oder RNA-Moleküle durch eine Reihe von nanoporösen Strukturen transportiert werden, die in einer Membran eingebettet sind. Störungen im elektrischen Strom, die beobachtet werden, während diese Moleküle die Nanoporen durchqueren, werden aufgezeichnet und in DNA-Sequenzdaten interpretiert. Diese Technologie zeichnet sich durch ihre schnelle, mobile und direkte Sequenzierung genetischen Materials aus und verzichtet auf die Notwendigkeit von Vorverstärkung oder Fragmentierung. Die Oxford-Nanopore-Sequenzierung hat sich als transformativ im Bereich der Genomik erwiesen, insbesondere in Nischen, die eine Langsequenzierung erfordern, wie z. B. de novo Genomassemblierung, Erkennung struktureller Varianten und Echtzeitüberwachung von Pathogenen. Durch die Integration eines vielseitigen und zugänglichen Designs hat die Oxford-Nanopore-Sequenzierung die Horizonte der genomischen Erkundung erweitert und ausgestattet Forscher mit einem dynamischen Werkzeug, das in der Lage ist, DNA oder RNA nach Belieben und am gewünschten Ort zu sequenzieren.

Prinzip der Nanoporen-Sequenzierung Yunhao (Wang et al., 2021)

Pacific Biosciences Sequenzierung: Einzelmolekül-Echtzeit (SMRT) Technologie

Pacific Biosciences (PacBio) Sequenzierungauf der Grundlage der Single-Molecule Real-Time (SMRT)-Technologie bietet der wissenschaftlichen Gemeinschaft Langzeit-Sequenzierungsfähigkeiten in Kombination mit erheblicher Genauigkeit. Abweichend von Illumina und Oxford-Nanopore-Sequenzierung Methoden, PacBio-Sequenzierung beobachtet die DNA-Synthese direkt in Echtzeit und nutzt die Anwendung von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden. Dieser innovative Ansatz erleichtert die Sequenzierung von langen DNA-Fragmenten und ermöglicht somit die Identifizierung von strukturellen Varianten, komplexen genomischen Umstellungen und epigenetischen Modifikationen. Diese Technik hat umfangreiche Anwendung in Bereichen wie Genomassemblierung, Metagenomik und transkriptomischs, wo die Fähigkeit, lange Reads zu erzeugen, entscheidend für das Entschlüsseln komplexer genomischer Regionen und das Erfassen vollständiger Transkripte ist. Während die PacBio-Sequenzierung oft eine geringere Durchsatzrate im Vergleich zur Illumina-Sequenzierung aufweisen kann, positioniert sich ihre Fähigkeit, lange, hochpräzise Reads zu erzeugen, als eine unschätzbare Ressource für spezifische genomische Analysen und ergänzt somit die Stärken alternativer Sequenzierungsplattformen.

PacBio-Sequenzierung Anthony Rhoads (u. a., 2015)

Ion Torrent-Sequenzierung: Halbleiterbasierte Sequenzierung

Ion Torrent-Sequenzierung, eine Erfindung von Life Technologies (derzeit mit Thermo Fisher Scientific fusioniert), nutzt Halbleitertechnologie zur DNA-Sequenzierung. Diese einzigartige Methode erkennt Wasserstoffionen, die während des Prozesses der Nukleotid-Integration freigesetzt werden, und ermöglicht eine Echtzeitüberwachung der DNA-Synthese. Ion Torrent-Sequenzierer bieten schnelle Durchlaufzeiten und anpassbare Ausgabekapazitäten, wodurch sie für ein breites Spektrum von Anwendungen geeignet sind, darunter, aber nicht beschränkt auf, fokussierte Amplicon-Sequenzierung, mikrobiologische Genomanalysen und Charakterisierung karzinogener Mutationen. Obwohl die von der Ion Torrent-Sequenzierung angebotenen Leseweiten möglicherweise nicht die der Konkurrenzplattformen übertreffen, machen ihre Schnelligkeit und die einfache Handhabung sie zu einem unverzichtbaren Instrument für regelmäßige Sequenzierungsaktivitäten in Forschungslaboren sowie in klinischen Umgebungen. Die Benutzerfreundlichkeit in Kombination mit der Kosteneffizienz der Ion Torrent-Sequenzierung unterstreicht ihre weit verbreitete Akzeptanz in zahlreichen genomischen Forschungsdisziplinen und bereichert das Spektrum der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien.

Vergleichende Übersicht über Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien

Hochdurchsatz-Sequenzierungsanwendung

Hochdurchsatz-Sequenzierung in der Transkriptomik

Transkriptomischs, eine aufschlussreiche Untersuchung von RNA-Transkripten, die vom Genom erzeugt werden, hat dank des Aufkommens von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien (HTS) enorme Fortschritte gemacht. Die Sequenzierung von RNA-Molekülen, die sorgfältig aus spezifischen Zellen oder Geweben extrahiert wurden, ermöglicht es Forschern, Muster der Genexpression, Fälle von alternativem Spleißen sowie posttranskriptionale Modifikationen zu entschlüsseln. Mit seinen breiten Anwendungsmöglichkeiten in verschiedenen Fachbereichen findet die HTS-basierte Transkriptomik Anwendung in der Genexpressionsprofilierung, der Entdeckung von nicht-kodierenden RNAs und der detaillierten Beschreibung von RNA-Modifikationen.

Genexpressionsprofilierung:

Eine der grundlegenden, aber entscheidenden Anwendungen von HTS im Bereich der transkriptomischs ist die Profilierung der Genexpression, ein Prozess, der die Quantifizierung der RNA-Transkript-Abundanz innerhalb eines biologischen Probenmaterials umfasst. Die Sequenzierung des Transkriptoms ermöglicht es Forschern, differentielle exprimierte Gene unter variablen experimentellen Bedingungen, klinischen Zuständen oder Entwicklungsphasen zu identifizieren. Die gewonnenen Informationen sind unverzichtbar für das Verständnis zellulärer Mechanismen, Signalwege und der regulatorischen Netzwerke, die biologischen Phänomenen zugrunde liegen. Beispielsweise hat die auf RNA-seq basierende Profilierung der Genexpression Vorteile bei der Untersuchung von Aspekten des Krebsfortschritts, der Entwicklung und therapeutischen Interventionen, wodurch potenzielle Biomarker und therapeutische Ziele aufgedeckt werden.

Identifizierung von nicht-kodierenden RNAs:

Das Aufkommen von HTS-Technologien war entscheidend für die Entdeckung und das Verständnis von nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs), die einen erheblichen Einfluss auf die Genregulation und zelluläre Mechanismen haben. Die Durchführung von Transkriptom-Sequenzierungen ermöglicht die Identifizierung verschiedener ncRNA-Unterklassen, einschließlich Mikro-RNAs (miRNAs), langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs) und zirkulärer RNAs (circRNAs). Diese ncRNAs beeinflussen verschiedene biologische Rollen wie Chromatin-Remodeling, RNA-Spleißung und posttranskriptionale Genregulation. Zum Beispiel wurden miRNAs mit verschiedenen Aspekten der Krebsentwicklung und -progression in Verbindung gebracht, wodurch sie die Expression von Genen beeinflussen, die an zellulärer Proliferation, Apoptose und Metastasierung beteiligt sind.

Charakterisierung von RNA-Modifikationen:

Darüber hinaus basierend auf HTS transkriptomischs erleichtert auch das Studium von RNA-Modifikationen wie m6A-Methylierung, Pseudouridylierung und RNA-Bearbeitung, die eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der RNA-Stabilität, der Übersetzungseffizienz und der Protein-RNA-Interaktionen spielen. Die hochpräzise Sequenzierung von RNA-Molekülen ermöglicht es Forschern, RNA-Modifikationen im gesamten Transkriptom zu kartieren und zu quantifizieren. Solche gewonnenen Informationen bereichern unser Verständnis der dynamischen Regulation der Genexpression und der funktionalen Auswirkungen von RNA-Modifikationen in Gesundheit und Krankheit. Es gibt Hinweise darauf, dass die Dysregulation der m6A-Methylierung an einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten beteiligt ist, einschließlich Krebs, neurodevelopmentale Störungen und Stoffwechselerkrankungen.

Hochdurchsatz-Sequenzierung in der genomischen Forschung

Die Ankunft von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien haben eine tiefgreifende Evolution im Bereich der Genomforschung katalysiert; sie ermöglichen die Fähigkeit, Genome, Transkriptome und Epigenome mit beispielloser Detailgenauigkeit und Präzision zu untersuchen. Mit der Entfaltung der Kapazitäten von HTS hat es sich in mehreren wissenschaftlichen Bereichen ausgebreitet und erhebliche Fußfassungen in den Bereichen Krebsgenomik, klinische Diagnostik, Umweltgenomik und persönliche Genomik gefunden.

Krebsgenomik:

Arguably eine der monumentalsten Anwendungen von HTS liegt im Bereich der Krebsgenomik. Es hat unser Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Architektur innerhalb von Tumoren grundlegend neu kalibriert und das bahnbrechende Feld der präzisionsonkologischen Forschung hervorgebracht. Durch die Sequenzierung sowohl der genomischen als auch der transkriptionalen Struktur dieser abweichenden Zellen können Wissenschaftler wichtige Informationen wie Treibermutationen, die Funktionalität onkogenetischer Pfade und entscheidende therapeutische Ziele ausgraben (Schwaederlé et al., 2015). Ein Beispiel dafür ist die Identifizierung hochspezifischer Mutationen in zentralen Genen wie EGFR, BRAF und ALK, die die Entwicklung gezielter Therapeutika vorangetrieben haben und das klinische Ergebnis für Patienten mit bestimmten Krebsarten revolutioniert haben (Hyman et al., 2017). Darüber hinaus bietet die Implementierung von HTS auf nicht-invasive Weise als Flüssigbiopsien eine robuste Überwachung des Tumorfortschritts und der Reaktion auf die Behandlung, was wertvolle Informationen über den Krankheitsverlauf und einen strategischen persönlichen Behandlungsansatz liefert (Diaz und Bardelli, 2014).

Klinische Diagnostik:

Im Bereich der klinischen Diagnostik hat sich HTS als bahnbrechendes Werkzeug etabliert, das eine umfassende Diagnose und maßgeschneiderte Behandlungsprotokolle bietet. Durch die Sequenzierung von patientenzentrierten Exomen oder Genomen können Kliniker das Vorhandensein von pathogenen Mutationen, genetischen Prädispositionen und pharmakogenomischen Markern entschlüsseln, die entscheidend für die Qualifizierung von Therapieansprechen sind (Yang et al., 2013). Dieser HTS-geführte Ansatz hat sich insbesondere bei der Diagnose seltener genetischer Störungen als einflussreich erwiesen, bei denen konventionelle Diagnosen oft auf unklare Ergebnisse stoßen (Bick et al., 2017).

Umweltgenomik:

HTS hat robuste Anwendungen, die über klinische Einstellungen hinausgehen. In der Umweltgenomik hat es eine neuartige Perspektive geliefert, um mikrobielle Gemeinschaften, Biodiversität und Ökosystemdynamik zu untersuchen. Durch die Sequenzierung von Umweltproben mittels metagenomischer Methoden können Forscher die Geheimnisse der mikrobiellen Vielfalt und deren Rolle in biogeochemischen Kreisläufen entschlüsseln (Tringe und Hugenholtz, 2008). Ein verbessertes Verständnis der Dynamik der Genexpression durch Transkriptomik und Metatranskriptomik informiert über effektives Ökosystemmanagement und Naturschutzstrategien.

Personen-Genomik:

In der persönlichen Genomik durchdringt der Nutzen von HTS-Technologien alle Bereiche und ermöglicht es Individuen, Einblicke in ihre genetischen Neigungen, Genealogien und Gesundheitsrisiken zu gewinnen. Es ermöglicht direkten Zugang zu genetischen Tests für Verbraucher, die es Einzelpersonen ermöglichen, personalisierte genomische Informationen für Ahnenforschung, Merkmalsanalyse und Vorhersage von Krankheitsanfälligkeiten zu erhalten (Tandy-Connor et al., 2018). Darüber hinaus hat HST bedeutende Anwendungen in der Pharmakogenomik, indem genetische Varianten identifiziert werden, die den Arzneimittelstoffwechsel und die Reaktionen auf Behandlungen beeinflussen, was den Weg für personalisierte Arzneimittelregime ebnet, die auf den einzigartigen Genotyp eines Individuums zugeschnitten sind (Caudle et al., 2014). Diese Fortschritte unterstreichen den tiefgreifenden und transformierenden Einfluss von HTS in der genomischen Forschung und treiben Durchbrüche in den Bereichen Medizin, Ökologie und personalisierte Gesundheitsversorgung voran.

Hochdurchsatz-Sequenzierung in der Epigenomik

EpigenomikDie Einbettung der Komplexität der Auswirkungen epigenetischer Veränderungen auf die Genexpression und zelluläre Phänotypen stellt eine entscheidende Disziplin dar, die Biologie und Medizin miteinander verbindet. Der Beginn der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien hat einen Paradigmenwechsel in der epigenomischen Forschung ausgelöst und ermöglicht eine umfassende Analyse der über das Genom verteilten epigenetischen Signaturen. Die Anwendungen von HTS sind vielfältig und erleichtern die Kartierung von DNA-Methylierung, Mustern der Histonmodifikation, Chromatinzugänglichkeit und bieten Einblicke in dreidimensionale Chromatinarchitekturen.

DNA-Methylierungsprofilierung:

DNA-Methylierung, gekennzeichnet durch die Hinzufügung von Methylgruppen zu Cytosinbasen, ist integraler Bestandteil der Regulierung der Genexpression, unterstützt die genomische Stabilität und hilft bei der zellulären Differenzierung. HTS-orientierte Methoden wie die Bisulfid-Sequenzierung und die reduzierte Repräsentations-Bisulfid-Sequenzierung (RRBS) haben die genomweite DNA-Methylierungsprofilierung in einen Bereich mit Einzel-Nukleotid-Auflösung vorangetrieben (Cokus et al., 2008). Die Sequenzierung von mit Bisulfid behandelten DNA-Proben hilft, methylierte und unmethylierte Cytosine offenzulegen und damit die DNA-Methylierungsmuster im gesamten Genom zu enthüllen. Solches Wissen ist von monumentaler Bedeutung, um die Bedeutung der DNA-Methylierung in der normalen Entwicklung, dem Altern sowie den Verwundbarkeiten gegenüber Krankheitszuständen wie Krebs und neurologischen Beeinträchtigungen zu verstehen (Meissner et al., 2008).

Histonmodifikationskartierung:

Histonmodifikationen, einschließlich Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung und Ubiquitinierung, sind entscheidend für die Strukturierung der Chromatin, die Genregulation und die Organisation des Genoms. HTS-integrierte Methoden, wie die Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq), haben die Kartierung von Histonmodifikationen im gesamten Genom revolutioniert (Barski et al., 2007). Die Sequenzierung von DNA-Fragmenten, die für spezifische Histonmodifikationen angereichert sind, erleichtert die Identifizierung von genomischen Regionen, die mit aktiven oder repressiven Chromatinzuständen verbunden sind. Dieses Wissen ist entscheidend, um die regulatorischen Mechanismen zu beleuchten, die die Genexpression, die Aktivität von Enhancern und die Dynamik des Chromatins im gesamten Spektrum von Gesundheit und Krankheit antreiben (Heintzman et al., 2007).

Chromatin-Zugänglichkeits-Assays:

Die Chromatinzugänglichkeit, ein Indikator für die Zugänglichkeit von DNA für regulatorische Proteine und Transkriptionsfaktoren, ist zentral für die Genexpression und die Funktionalität regulatorischer Elemente. HTS-gesteuerte Assays wie der Assay für transposase-zugängliches Chromatin mittels Sequenzierung (ATAC-seq) und DNase-seq ermöglichen eine hochauflösende, genomweite Profilierung der Chromatinzugänglichkeit (Buenrostro et al., 2013). Die Sequenzierung zugänglicher Chromatinregionen hilft dabei, aktive regulatorische Faktoren wie Promotoren, Enhancer und Isolatoren zu identifizieren und ihre Rollen in der Genregulation und der Zellidentität offenzulegen. Solche Erkenntnisse sind entscheidend, um die epigenetische Grundlage der zellulären Differenzierung, der Gewebeentwicklung und der Krankheitsätiologie zu entschlüsseln (Song und Crawford, 2010).

Dreidimensionale Chromatinarchitektur:

Die neuesten Fortschritte in HTS-Technologien haben auch die Erforschung der dreidimensionalen Chromatinarchitektur und der genomischen Organisation erleichtert. Protokolle wie Hi-C, die Analyse von Chromatininteraktionen durch Paar-End-Tag-Sequenzierung (ChIA-PET) und HiChIP ermöglichen es Forschern, die räumliche Genomorganisation zu untersuchen und Chromatinschleifen sowie Domänenbildungen zu erkennen (Lieberman-Aiden et al., 2009; Fullwood et al., 2009). Die Sequenzierung von Chromatininteraktionen erleichtert den Aufbau dreidimensionaler Genommodelle und das Erkennen von Langstreckeninteraktionen zwischen regulatorischen Faktoren und Zielgenen. Diese Informationen sind entscheidend, um die überlegene Chromatinstruktur, die Prinzipien der Genomfaltung und die räumliche Genomorganisation im Zellkern zu verstehen (Rao et al., 2014).

Hochdurchsatz-Sequenzierung in der Mikrobiomanalyse

Forschungen zum Mikrobiom, einem Schwerpunkt auf weit verbreiteten mikrobielle Gemeinschaften in verschiedenen Ökosystemen, haben mit dem Aufkommen von bedeutenden Fortschritten erlebt. Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien. Diese Kritik hebt die zentrale Rolle von HTS bei der Aufklärung der Zusammensetzung und Funktion des Mikrobioms hervor und betont die Anwendungen bei der Erforschung der mikrobiellen Vielfalt, der Unterscheidung von Gemeinschaftsstrukturen, der Durchführung funktioneller Profilierungen und der Aufklärung der komplexen Mikrobiom-Wirt-Assoziationen.

Charakterisierung der mikrobiellen Vielfalt:

HTS hat sich als ein bahnbrechender Ansatz zur Entmystifizierung der mikrobiellen Vielfalt herausgestellt und bietet ein umfassendes Porträt mikrobieller Gemeinschaften in verschiedenen Ökosystemen wie dem menschlichen Darm, Boden, Ozean und atmosphärischen Milieus. Durch Techniken wie die Amplicon-Sequenzierung des 16S ribosomalen RNA-Gens und Whole-Genome-Shotgun-Metagenomik-SequenzierungDie taxonomische Zusammensetzung und Häufigkeit mikrobieller Bestandteile innerhalb von Proben wird erkennbar (Turnbaugh et al., 2007). Durch die Ermöglichung der parallelen Analyse von Millionen von DNA-Sequenzen befähigt HTS Forscher, schwer fassbare und relativ seltene mikrobielle Arten zu identifizieren, Gemeinschaftsdynamiken zu entschlüsseln und den Einfluss von Umweltvariablen auf die mikrobielle Vielfalt zu bewerten.

Entschlüsselung der Gemeinschaftsstruktur:

Über die taxonomische Profilierung hinaus birgt HTS erhebliches Potenzial zur Aufklärung der Architektur und Zusammensetzung mikrobieller Gemeinschaften. Durch die Erzeugung komplexer Daten über mikrobielle Populationen ermöglicht HTS die Erkennung von Gemeinschaftsverschiebungen, ökologischen Verbindungen und Schlüsselarten innerhalb komplexer mikrobieller Ökosysteme. Ansätze wie die metagenomische Sequenzierung liefern robuste Beweise für das funktionale Potenzial mikrobieller Gemeinschaften und bieten Einblicke in deren Beteiligung am Nährstoffkreislauf, an der Bioremediation und an der Krankheitsausbreitung (Gilbert et al., 2010). Die Entwicklung der Einzelzell-Sequenzierungstechnik hat zudem die genomische Vielfalt, die metabolischen Kapazitäten und die interaktiven Netzwerke einzelner mikrobieller Zellen innerhalb einer Gemeinschaft weiter aufgedeckt.

Funktionales Profiling und Metagenomik:

Die Bereitstellung von HTS in metagenomische Sequenzierung ermöglicht die Erforschung des funktionalen Potenzials mikrobieller Gemeinschaften durch die kollektive Untersuchung des genetischen Inhalts in einer Probe. Metagenomische Untersuchungen offenbaren die Nuancen des mikrobiellen Stoffwechsels, der Genfunktionen und der Wege, die an Umweltprozessen und der Wechselwirkung zwischen Wirt und Mikrobiom beteiligt sind (Qin et al., 2010). Durch die Annotation von Genen und die Vorhersage von Stoffwechselwegen ermöglicht die Metagenomik die Identifizierung mikrobieller Eigenschaften, die für biogeochemische Kreisläufe, Antibiotikaresistenz und das Wohlbefinden des Wirts relevant sind. Ergänzend zur Metagenomik sind metatranskriptomische und metaproteomische Methoden, die jeweils die aktive Genexpression und die Proteinprofile mikrobieller Gemeinschaften aufdecken und somit dynamische Einblicke in funktionale Aktivitäten bieten.

Mikrobiom-Wirt-Interaktionen:

HTS bildet die Grundlage für ein nuanciertes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Mikrobiom und Wirt sowie deren Einfluss auf die menschliche Gesundheit und das Auftreten von Krankheiten. Untersuchungen, die durch HTS unterstützt werden, haben das Licht auf die Rolle des Darmmikrobioms bei der Modulation des Wirtstoffwechsels, der Immunantwort und der Anfälligkeit für eine Vielzahl von Erkrankungen wie Fettleibigkeit, entzündliche Darmerkrankungen und Stoffwechselstörungen geworfen (Arumugam et al., 2011). Die Integration von multi-omischen Daten aus Mikrobiom- und Wirtproben ermöglicht es Forschern, die komplexe Wechselwirkung zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und der physiologischen Reaktion des Wirts zu entschlüsseln, was potenziell personalisierte Medizinstrategien zur Zielsetzung des Mikrobioms ermöglicht.

Schematische Darstellung, die die Anwendungen von Hochdurchsatz-Sequenzierung für Studien zur Epidemiologie, Evolution und Pathogenese bakterieller Infektionen zusammenfasst. (Paul R McAdam et al., 2014)

Hochdurchsatz-Sequenzierungsschritte

Bibliotheksvorbereitung:

Die Anfangsphase in Hochdurchsatz-Sequenzierung erfordert die Erstellung einer Bibliothek, in der DNA- oder RNA-Proben fragmentiert, mit Sequenzierungsadaptern markiert und anschließend amplifiziert werden, was zur Produktion von Sequenzierungsbibliotheken führt. Obwohl die spezifischen Anforderungen jeder Anwendung und die verwendete Sequenzierungsplattform diesen Prozess leicht verändern können, umfasst der Standardansatz enzymatische Reaktionen, Reinigungsprozesse und die Bewertung der Qualitätskontrolle, um sicherzustellen, dass die resultierenden Sequenzierungsbibliotheken Integrität und Zuverlässigkeit aufweisen.

Sequenzierung:

Nach der erfolgreichen Vorbereitung der Sequenzierungsbibliotheken besteht der nächste Schritt darin, diese vorbereiteten Bibliotheken auf die Sequenzierungsplattform zu laden. In dieser Phase wird eine Sequenz von Nukleotidbasen schrittweise in die Bildung wachsender DNA-Stränge integriert. Mit jeder einzelnen Einfügung einer Base zeichnet das Sequenzierungsinstrument diese auf und identifiziert sie. Die in Hochdurchsatzverfahren verwendeten Sequenzierungsplattformen erzeugen eine enorme Menge an Rohsequenzierungsdaten. Diese Rohdaten erfordern eine anschließende Verarbeitung und analytische Untersuchung, um biologisch bedeutungsvolle Informationen zu extrahieren.

Datenanalyse:

Hochdurchsatz-Sequenzierung unterstreicht die entscheidende Bedeutung der Datenanalyse, die die Handhabung, Ausrichtung und Interpretation der erzeugten Sequenzierungsdaten umfasst. Bioinformatik-Pipelines werden genutzt, um Rohdaten zu kürzen, sie mit Referenzgenomen oder Transkriptomen abzugleichen und genetische Variationen oder Muster der differentiellen Genexpression zu erkennen. Dank fortschrittlicher Rechenmechanismen und Algorithmen sind Forscher in der Lage, biologische Erkenntnisse aus großangelegten Sequenzierungsdatensätzen zu gewinnen, wodurch neuartige Entdeckungen in verschiedenen Forschungsbereichen wie der genetischen Grundlage von Krankheiten, der Evolutionsbiologie und der personalisierten Medizin erleichtert werden.

Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierung.
(A) Nasslabor-Schritte und (B) Trockenlabor-Schritte. Die Einzelheiten jedes Schrittes sind im Text beschrieben. (Maloyjo Joyraj Bhattacharjee, Basant K. Tiwary, in Biotechnologie im Gesundheitswesen, 2022)

Datenanalyse in der Hochdurchsatz-Sequenzierung

Die Datenanalyse ist ein entscheidender Bestandteil von Hochdurchsatz-Sequenzierungs-Workflows, da sie die Verarbeitung, Interpretation und Ableitung bedeutungsvoller Erkenntnisse aus den riesigen Mengen an Sequenzierungsdaten umfasst, die von HTS-Plattformen erzeugt werden. Die Komplexität der HTS-Daten, die von Millionen bis Milliarden kurzer DNA- oder RNA-Sequenzen reichen kann, erfordert ausgeklügelte bioinformatische Werkzeuge und rechnergestützte Algorithmen, um biologische Informationen genau und effizient zu extrahieren.

Vorverarbeitung und Qualitätskontrolle

Der erste Schritt in der HTS-Datenanalyse umfasst die Vorverarbeitung und Qualitätskontrolle, um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Sequenzierungsdaten sicherzustellen. Dazu gehört das Trimmen von Adaptersequenzen, das Filtern von niedrigqualitativen Reads sowie das Entfernen von Sequenzierungsartefakten und kontaminierenden Sequenzen. Werkzeuge wie FastQC, Trimmomatic und Cutadapt werden häufig zur Qualitätsbewertung und Vorverarbeitung von HTS-Daten verwendet (Andrews et al., 2010; Bolger et al., 2014; Martin, 2011).

Lesen von Mapping und Ausrichtung

Sobald die Rohsequenzierungsdaten vorverarbeitet wurden, besteht der nächste Schritt in der Lesekartierung und -ausrichtung, bei dem die kurzen Sequenzlesungen an ein Referenzgenom oder Transkriptom ausgerichtet werden, um ihre genomischen oder transkriptomischen Ursprünge zu identifizieren. Dieser Prozess umfasst die Ausrichtung jeder Lesung an der Referenzsequenz, wobei Fehlanpassungen, Einfügungen und Löschungen berücksichtigt werden. Beliebte Algorithmen zur Lesekartierung sind Bowtie, BWA und HISAT2, die unterschiedliche Strategien für eine effiziente und genaue Ausrichtung kurzer Lesungen verwenden (Langmead et al., 2009; Li und Durbin, 2009; Kim et al., 2015).

Variant-Erkennung und -Aufruf

Die Variantenbestimmung ist ein kritischer Schritt in der HTS-Datenanalyse, insbesondere in genomischen Studien, bei dem es darum geht, einzelne Nukleotidvarianten (SNVs), Insertionen, Deletionen und strukturelle Variationen in den sequenzierten Genomen zu identifizieren. Algorithmen zur Variantenbestimmung wie GATK, FreeBayes und VarScan nutzen statistische Modelle und maschinelles Lernen, um Varianten aus ausgerichteten Sequenzierungsreads zu erkennen, wobei Sequenzierungsfehler, Lesetiefe und Mapping-Qualität berücksichtigt werden (McKenna et al., 2010; Garrison und Marth, 2012; Koboldt et al., 2012).

Transkriptquantifizierung und Analyse der differentiellen Expression

In transkriptomischen Studien umfasst die HTS-Datenanalyse die Quantifizierung der Genexpressionsniveaus und die Identifizierung von differentiell exprimierten Genen zwischen experimentellen Bedingungen. Dies erfordert typischerweise das Mapping von RNA-seq-Lesungen auf ein Referenztranskriptom und die Schätzung der Transkriptmengen mit Tools wie Salmon, Kallisto und RSEM (Patro et al., 2017; Bray et al., 2016; Li et al., 2011). Die anschließende Analyse der differentiellen Expression verwendet statistische Methoden wie DESeq2, edgeR und limma, um Gene zu identifizieren, die zwischen den experimentellen Gruppen signifikant hoch- oder herunterreguliert sind (Love et al., 2014; Robinson et al., 2010; Ritchie et al., 2015).

Funktionale Annotation und Pfadanalyse

Um biologische Erkenntnisse aus HTS-Daten zu gewinnen, werden funktionale Annotation und Pfadanalyse durchgeführt, um Gene zu annotieren, ihre Funktionen vorherzusagen und angereicherte biologische Pfade oder Gene-Ontologie-Begriffe zu identifizieren. Werkzeuge wie DAVID, Enrichr und g:Profiler werden häufig für die funktionale Anreicherungsanalyse verwendet, um Forschern zu ermöglichen, die biologische Bedeutung von differentiell exprimierten Genen oder genetischen Varianten zu interpretieren (Huang et al., 2009a, 2009b; Chen et al., 2013; Raudvere et al., 2019).

Herausforderungen und Chancen

Während HTS beispiellose Möglichkeiten für die genomische Forschung bietet, stellt es auch mehrere Herausforderungen dar, insbesondere bei der Datenanalyse. Die Verwaltung und Interpretation großer Mengen an Sequenzierungsdaten erfordert ausgeklügelte rechnergestützte Methoden und eine robuste bioinformatische Infrastruktur. Darüber hinaus ist die Sicherstellung der Datenqualität und Reproduzierbarkeit von größter Bedeutung, was rigorose Validierung und Benchmarking von Analysepipelines notwendig macht. Fortschritte in den Bereichen maschinelles Lernen, Cloud-Computing und Datenvisualisierung verbessern jedoch die Fähigkeiten von bioinformatischen Werkzeugen und ermöglichen es Forschern, tiefere Einblicke aus HTS-Daten zu gewinnen.

Hochdurchsatz-Sequenzierung FAQ

Sind NGS und HTS dasselbe?

NGS und HTS beziehen sich auf dieselbe Technologie: Next-Generation Sequencing und Hochdurchsatz-Sequenzierung sind synonyme Begriffe, die im Bereich der Genomik austauschbar verwendet werden.

Was ist der Zweck von Hochdurchsatz-Sequenzierung?

Der Zweck von Hochdurchsatz-Sequenzierung besteht darin, DNA- und RNA-Moleküle in großem Maßstab schnell zu sequenzieren und revolutioniert die genomische Forschung. Diese Technologie ermöglicht es Forschern, gesamte Genome oder Transkriptome effizient zu analysieren und Einblicke in genetische Variation, Genexpression und andere biologische Prozesse zu gewinnen.

Referenzen:

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