16S rRNA-Sequenzierung vs. Metagenom-Sequenzierung: Ein Leitfaden zur Auswahl

Die Mikrobiomforschung hat unser Verständnis komplexer mikrobielle Gemeinschaften revolutioniert, und zwei entscheidende Techniken an der Spitze dieser Erkundung sind 16S rRNA-Sequenzierung und Metagenom-Sequenzierung. Diese Methoden, jede mit ihren eigenen Stärken und Anwendungen, ermöglichen es Wissenschaftlern, die Komplexität mikrobieller Ökosysteme zu entschlüsseln. In diesem Artikel gehen wir näher auf die Feinheiten dieser Techniken ein und bieten einen umfassenden Leitfaden, um Forschern bei der Entscheidung zwischen 16S rRNA-Sequenzierung und Metagenom-Sequenzierung basierend auf ihren spezifischen Forschungszielen.

Übersicht über 16S rRNA-Gen-NGS- und Shotgun-Metagenomik-Methoden. (Boers et al., 2019)

16S rRNA-Sequenzierung

Der 16S ribosomale DNA (rRNA) Sequenzierung Die Technik zielt auf ein Segment innerhalb der kleinen Untereinheit prokaryotischer Ribosomen ab, das eine Länge von 1300 bis 1600 Basenpaaren aufweist. Dieser Bereich enthält 10 konservierte Regionen, die die evolutionäre Verwandtschaft zwischen biologischen Arten widerspiegeln, sowie 9 hochvariable Regionen, die interspezifische Unterschiede hervorheben. Die konservierten Regionen dienen als Grundlage für die taxonomische Identifikation, während die variablen Regionen einzigartige Unterschiede zwischen den Arten zusammenfassen. Typischerweise erfolgt eine PCR-Amplifikation einer hochvariablen Region (wie V4 oder V3-V4) oder der gesamten Länge der 16S rRNA-Sequenz, gefolgt von einer Sequenzierung.

Bitte beziehen Sie sich auf unseren Artikel. Prinzipien und Arbeitsablauf der 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung.

Metagenom-Sequenzierung

Die Metagenom-Sequenzierung überschreitet die Grenzen individueller 16S rRNA-Sequenzen, indem sie sämtliches genetisches Material innerhalb einer Probe umfasst, einschließlich Wirts-DNA und mikrobieller Genome. Dieser umfassende Ansatz gewährt Einblicke in sowohl die taxonomische Zusammensetzung als auch das funktionale Potenzial. Durch Hochdurchsatz-Sequenzierung von Umwelt-DNA, Metagenom-Sequenzierung ermöglicht Analysen, die die mikrobielle Gemeinschaftsstruktur, den Geninhalt und funktionale Wege umfassen.

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Faktoren, die die Entscheidung lenken

• Forschungsziele

Die Formulierung präziser Forschungsziele hat höchste Bedeutung. Wenn die Absicht darin besteht, Aspekte wie Artenzusammensetzung, Vielfalt und relative Häufigkeit zu entschlüsseln, wird die Anwendung der 16S rRNA-Sequenzierung zu einer klugen Wahl. In Szenarien, in denen Untersuchungen in detaillierte Aspekte wie spezifische Funktionen, Geninhalt und komplexe Stoffwechselwege eintauchen, erweist sich die Metagenom-Sequenzierung als der bevorzugte und passendere Ansatz.

• Taxonomische Auflösung

16S rRNA-Sequenzierung zeichnet sich durch eine höhere taxonomische Präzision aus und reicht häufig bis auf die Ebenen von Gattung oder Art. Im Gegensatz dazu, Metagenom-Sequenzierung liefert überlegene Präzision, die die Unterscheidung subtiler Unterschiede auf der Ebene der Stämme ermöglicht und bemerkenswerterweise das Potenzial zur Rekonstruktion vollständiger Genome bietet.

• Kosten und Durchsatz

Es ist unerlässlich, finanzielle Einschränkungen zu berücksichtigen. 16S rRNA-Sequenzierung bietet eine wirtschaftlich tragfähige und hochgradig effiziente Lösung, die besonders vorteilhaft ist, wenn es um umfangreiche Gemeinschaftsprofilierungsprojekte geht. Im Gegensatz dazu sind die Kosten für Metagenom-Sequenzierung höher, da das erhebliche Datenvolumen und die damit verbundenen rechnerischen Anforderungen anfallen.

• Stichprobenkomplexität

Bei der Arbeit mit Proben, die eine klar definierte Gruppe bekannter Mikroorganismen enthalten, erweist sich die 16S-rRNA-Sequenzierung als angemessen und passend. Im krassen Gegensatz dazu glänzt die Metagenom-Sequenzierung wirklich, wenn es darum geht, komplexe und vielfältige Proben zu erkunden, die neuartige oder schlecht charakterisierte Arten beherbergen.

• Funktionale Einblicke

Die Metagenom-Sequenzierung ermöglicht es Forschern, komplexe funktionale Einblicke zu enthüllen. Dazu gehört die Fähigkeit, Stoffwechselwege vorherzusagen und potenzielle funktionale Rollen zu identifizieren. Solche Enthüllungen sind von immensem Wert, insbesondere für Studien, die die Bereiche Ökologie, Medizin und Biotechnologie durchqueren.

16S rRNA-Sequenzierung vs. Metagenomische Sequenzierung

Die Kombination beider Methoden kann umfassende Einblicke liefern. Nutzen Sie die 16S rRNA-Sequenzierung für die taxonomische Profilierung und die erste Gemeinschaftsbewertung und wenden Sie anschließend die Metagenom-Sequenzierung an, um das funktionale Potenzial und feinere taxonomische Nuancen zu entschlüsseln.

Fazit

• Kostenbeschränkungen: Wählen Sie 16S rRNA-Sequenzierung, wenn das Budget begrenzt ist.
• Forschungsfokus: Für die Artenzusammensetzung und Diversität reicht die 16S rRNA-Sequenzierung aus. Die Metagenom-Sequenzierung ist entscheidend für funktionale und genebene Untersuchungen.
• Genomakquisition: Metagenom-Sequenzierung bietet genomische Einblicke, selbst für unkultivierte Bakterien.
• Hybrider Ansatz: Kombinieren Sie 16S rRNA-Sequenzierung mit Metagenom-Sequenzierung für kosteneffektive Studien auf Artenebene sowie tiefere funktionale Analysen.
• Wirtverschmutzung: Wählen Sie 16S rRNA-Sequenzierung für Proben mit potenzieller Kontamination durch eukaryotische Wirts-DNA.

Fallstudien

Fallstudie 1 - Erforschung des bakteriellen Mikrobioms von Amazonasboden

In dieser illustrativen Studie liegt der Fokus auf der Untersuchung des komplexen bakteriellen Mikrobioms im Amazonasboden. Angesichts der zuvor erläuterten Umstände, in denen bestimmte Taxa selten oder unzureichend untersucht sein könnten, erweist sich die Wahl von bakteriellen 16S rRNA-Datenbanken als vorteilhaft. Diese Entscheidung resultiert aus dem Mangel an leicht verfügbaren vollständigen Referenzgenomen für diese spezifischen Arten. Daher würde die Nutzung von 16S rRNA-Sequenzierung eine verbesserte taxonomische Auflösung im Vergleich zur metagenomischen Sequenzierung bieten, was gut mit den Zielen der Studie übereinstimmt.

Fallstudie 2 - Verfolgung von Mikrobiomveränderungen und dem Vorhandensein antimikrobieller Gene nach einer Stuhltransplantation

Der herausragende Vorteil der metagenomischen Sequenzierung liegt in ihrer Fähigkeit, vielschichtige funktionale Einblicke in das Mikrobiom zu bieten, einschließlich mikrobieller Gen-Daten. Für das hier skizzierte Szenario, eine Studie, die darauf abzielt, Veränderungen in der Zusammensetzung des Mikrobioms und das Tragen von antimikrobiellen Genen nach einer Stuhltransplantation zu entschlüsseln, erweist sich die metagenomische Sequenzierung als die bevorzugte Wahl. Durch die Anwendung der metagenomischen Sequenzierung kann die Untersuchung effektiv Veränderungen in der Zusammensetzung des Darmmikrobioms erfassen und gleichzeitig eine umfassende Profilierung von Genen des antimikrobiellen Widerstands sowie deren zugehörigen Wirten durchführen.

Fallstudie 3 - Tägliche Dynamik des Mikrobioms im Darm nach einer 2-wöchigen Intervention mit Ballaststoffen

Im Kontext der Untersuchung der täglichen Schwankungen im Mikrobiom des Darms aufgrund einer zweiwöchigen Intervention mit Ballaststoffen treten bestimmte Fälle auf, in denen Modifikationen überwiegend auf funktioneller Ebene sichtbar werden. In einem solchen Studienkontext wäre eine sorgfältige Auswahl das flache Shotgun-Sequenzieren. Dieser Ansatz ermöglicht es einzigartig, sowohl die Zusammensetzungsvariationen (wie Arten- oder Stammverschiebungen) als auch die funktionalen Unterschiede im Mikrobiom des Darms infolge der diätetischen Intervention zu bewerten. Bemerkenswerterweise bietet diese Methode diese analytischen Vorteile zu vergleichbaren Kosten wie die 16S rRNA-Sequenzierung.

Referenz:

1. Boers, Stefan A., Ruud Jansen und John P. Hays. "Verstehen und Überwinden der Fallstricke und Verzerrungen von Next-Generation-Sequencing (NGS)-Methoden für den Einsatz im routinemäßigen klinischen mikrobiologischen Diagnoselabor." Europäische Zeitschrift für klinische Mikrobiologie und Infektionskrankheiten 38 (2019): 1059-1070.