NGS-basierter B-Zell-Rezeptor-Sequenzierungsprotokoll

Amplifikation von VH-Cg, VH-Ca oder VH-Cμ aus cDNA

1. Bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor, der aus 28,3 μl Wasser, 5 μl 10× Puffer Gold, 3 μl MgCl2, 0,5 μl dNTPs, 1 μl BSA und 0,2 μl Taq Gold besteht.
2. Übertragen Sie das PCR-Mastermix in die PCR-Reaktionsröhrchen (38 μl in jede Vertiefung).
3. Geben Sie 1 μl jedes Primers in den entsprechenden Brunnen.
4. Fügen Sie 5 μl cDNA in das entsprechende Wells hinzu und setzen Sie vorsichtig den Deckel der PCR-Röhrchen auf.
5. Führen Sie die PCR bei 95 °C für 7 Minuten durch; 25–35 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute; 72 °C für 10 Minuten.
6. Laden Sie 50 μl PCR-Produkt mit 10 μl Ladefarbstoff auf ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer mit Ethidiumbromid und lassen Sie es 1 Stunde bei 180 V laufen.
7. Visualisieren Sie das DNA-Band unter ultraviolettem (UV) Licht und schneiden Sie das PCR-Band von etwa 500 bp mit einem Skalpell aus dem Gel.
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt aus dem Gel mit dem Gel-Extraktionskit. Befolgen Sie die Anweisungen im Handbuch und eluieren Sie mit 20 μl Elutionspuffer.
9. Fahren Sie mit Unterüberschrift 3.3, Verschachtelte PCR, fort.

Amplifikation von VH-JH aus DNA

1. Bereiten Sie einen PCR-Mastermix vor, der aus 31,3 μl Wasser, 5 μl 10× Puffer Gold, 3 μl MgCl2, 0,5 μl dNTPs, 1 μl BSA und 0,2 μl Taq Gold besteht.
2. Übertragen Sie das PCR-Mastermix in die PCR-Reaktionsröhrchen (41 μl in jedes Wells).
3. Geben Sie 1 μl jedes Primers (6 5′-Primer und 1 Cg- oder Ca-Primer pro Vertiefung) in die entsprechende Vertiefung.
4. Fügen Sie 2 μl 50 ng/μl DNA in das entsprechende Wells hinzu und setzen Sie vorsichtig den Deckel der PCR-Röhrchen auf.
5. Führen Sie die PCR bei 95 °C für 7 Minuten durch; 25–35 Zyklen bei 94 °C für 30 Sekunden, 57 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 1 Minute; 72 °C für 10 Minuten.
6. Laden Sie 50 μl PCR-Produkt mit 10 μl Ladefarbstoff auf ein 1% Agarosegel in TBE-Puffer mit Ethidiumbromid und lassen Sie es 1 Stunde bei 180 V laufen.
7. Visualisieren Sie das DNA-Band unter ultraviolettem (UV) Licht (siehe Hinweis 7) und schneiden Sie das PCR-Band von etwa 500 bp mit einem Skalpell aus dem Gel.
8. Reinigen Sie das PCR-Produkt aus dem Gel mit dem Gel-Extraktionskit. Befolgen Sie die Anweisungen im Handbuch und eluieren Sie mit 20 μl Elutionspuffer.

Verschachtelte PCR und Pooling

1. Fügen Sie 12,5 μl KAPA HiFi Hotstart Ready Mix, 2 μl TruSeq Custom Amplicon Index Vorwärtsprimer, 2 μl TruSeq Custom Amplicon Rückwärtsprimer und 8,5 μl gereinigtes PCR-Produkt zu einem PCR-Reaktionsgefäß hinzu.
2. Führen Sie die PCR bei 95 °C für 5 Minuten durch; 10 Zyklen bei 98 °C für 20 Sekunden, 66 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 30 Sekunden; 72 °C für 1 Minute.
3. Messen Sie die Konzentration der PCR-Produkte.
4. Mischen Sie das PCR-Produkt in einer äquimolaren Konzentration von 50 mM.
5. Reinigen Sie das Pool von PCR-Produkten.
6. Der PCR-Pool kann mit der Illumina-Plattform sequenziert werden.

Zusammenführen, Trimmen und Ausrichten von Reads mit Galaxy

1. Die Sequenzierung mit der Illumina-Plattform ergibt R1- und R2-Reads, die vor der Ausrichtung auf eine Referenzdatenbank zusammengeführt werden müssen.
2. Nachdem die Reads zusammengeführt wurden, müssen die Illumina Rd1- und Rd2-Primeradapter sowie die Vorwärtsprimer von den Reads entfernt werden.
3. Bevor die Reads mit IMGT/HighV-Quest ausgerichtet werden können, müssen die FASTQ-Dateien an das FASTA-Dateiformat angepasst werden. Dies kann mit dem FASTQ-zu-FASTA-Konverter durchgeführt werden.
4. Für die Ausrichtung und Annotation der BCR-Umschichtungen kann das internationale ImMunoGeneTics-System IMGT/HighV-Quest verwendet werden.

Datenanalyse mit der Immune Repertoire Pipeline in Antigenrezeptor Galaxy

1. Öffne ARGalaxy.
2. Laden Sie die komprimierten .txz-Dateien hoch, indem Sie: Daten abrufen → Datei hochladen. Die Datei erscheint auf der rechten Seite Ihres Bildschirms unter "Verlauf."
3. Wählen Sie unter "Werkzeuge" auf der linken Seite des Bildschirms "ARGalaxy" und klicken Sie auf die "Immune Repertoire Pipeline."
4. Wählen Sie die .txz-Datei aus, die Sie analysieren möchten.
Geben Sie einen Namen im Feld "ID" ein.
6. Wählen Sie die Definition des Klonotyps aus.
7. Wählen Sie die Reihenfolge aus, in der die V-, D- und J-Gene in den Grafiken erscheinen müssen. Die Standardeinstellung ist alphabetisch und nicht in der Reihenfolge, in der sie im IGH-Lokus erscheinen.
8. Wählen Sie "IGH" im Feld "Locus".
9. Wählen Sie, ob Sie die unproduktiven Umstellungen in den Grafiken visualisieren möchten.
10. Wählen Sie aus, ob Sie überlappende Sequenzen zwischen verschiedenen Replikaten innerhalb eines Spenders identifizieren möchten.
11. Drücken Sie Ausführen. Ein neuer Eintrag wird in Ihrer Historie angezeigt und wird grün, wenn das Tool bereit ist, die Daten zu verarbeiten.
12. Klicken Sie auf das "Auge"-Symbol, um die Tabelle zu öffnen, die einen Überblick über die Umstellungen zeigt, einschließlich des Anteils an produktiven, produktiv einzigartigen, unproduktiven und unproduktiv einzigartigen.
13. Klicken Sie auf "Hier für die Ergebnisse klicken", um die Seite mit den verschiedenen Analyse-Registerkarten zu öffnen.
14. Der Tab "Genfrequenzen" zeigt den Prozentsatz der Nutzung von V-, D- und J-Gen. Die Häufigkeit der verschiedenen V-, D- und J-Gene variiert leicht zwischen Individuen und auch zwischen verschiedenen Primer-Sets, die zur Amplifikation der BCR-Neuarrangements verwendet werden.
15. Der Tab "CDR3-Eigenschaften" enthält Diagramme, die die Verteilung der CDR3-Länge und die Häufigkeit der verschiedenen in der CDR3 verwendeten Aminosäuren zeigen. Die mediane CDR3-Länge ist bei naiven B-Zellen länger im Vergleich zu Gedächtnis-B-Zellen, was wahrscheinlich durch eine Selektion gegen lange CDR3-Längen verursacht wird, da diese eher autoreaktiv sind.
16. Im Tab "Heatmaps" wird die Häufigkeit der verschiedenen Kombinationen von V-J-, V-D- und D-J-Genen in Heatmaps visualisiert.
17. Im Tab "Heatmaps vergleichen" können die Heatmaps zwischen verschiedenen Spendern verglichen werden.
18. Im Tab "Circos" wird die Häufigkeit der verschiedenen Kombinationen von V-J-, V-D- und D-J-Genen mithilfe von Zirkusdiagrammen visualisiert.
19. Wenn die Option gewählt wird, um die Anzahl der Sequenzen zu bestimmen, die denselben klonalen Typ zwischen Replikaten teilen, oder um die Klonalität des Spenders zu bestimmen, wird der Tab "Geteilte klonale Typen" oder "Klonalität" angezeigt. Diese Tabs enthalten eine Tabelle mit Informationen über die Anzahl der BCR-Umbauten, die in mehreren Replikaten desselben Spenders vorhanden sind. Wenn drei Replikate vorhanden sind und die Option "die Klonalität des Spenders bestimmen" gewählt wird, wird der Klonalitätswert basierend auf der Veröffentlichung von Boyd et al. angegeben. Bei Patienten mit IEI ist die Vielfalt des Repertoires oft reduziert.
20. Der Tab "Junctionsanalyse" enthält eine Tabelle mit der Median- oder Durchschnittszahl von Deletionen, palindromischen (P) Nukleotiden oder nicht-templatierten (N) Nukleotiden in den produktiven und unproduktiven Umlagerungen. Genetische Defekte im nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfungs (NHEJ) Weg haben gezeigt, dass sie die Anzahl der Deletionen, N-Nukleotide und P-Nukleotide beeinflussen.
21. Im Tab "Download" können alle Daten, die zur Erstellung der Tabellen und Grafiken verwendet wurden, heruntergeladen werden. 

Referenz:

1. Schouwenburg P A, Burg M, IJspeert H. NGS-basierte Analyse des B-Zell-Rezeptor-Repertoires. Repertoireanalysen im Kontext von angeborenen Immunfehlern [M]//Immunogenetik. Humana, New York, NY, 2022: 169-190.