Mikrobielle Ganzgenomsequenzierung durch NGS-Protokoll

Sammlung von Zellen durch Mikromanipulation

1. Tragen Sie 2 ml von 1× LB in ein steriles, 0,2 ml PCR-Röhrchen auf und inkubieren Sie es auf Eis oder in einem PCR-Kühler.
2. Befestigen Sie eine Glas-Kapillare mit einem Durchmesser von 30-100 mm an Mikromanipulatoren. Der Durchmesser der Kapillare hängt von der Größe der Zellen ab, die den Ziel-bakteriellen Symbionten beherbergen.
3. Markieren Sie die Position, die der Tiefe eines 0,2 ml PCR-Röhrchens auf einer Glas-Kapillare mit 15 mm Durchmesser entspricht, und befestigen Sie es am anderen Mikromanipulator.
Tragen Sie 50 ml von Lösung U fünf bis zehn Mal auf die Innenseite des Deckels auf.
5. Sammeln Sie die Wirt-Protisten-Zellen.
6. Waschen Sie die Zellen mehr als viermal.
Tragen Sie 50 ml einer 1%igen NP-40-Lösung auf die Innenseite des Deckels einer neuen Petrischale auf.
8. Sammeln Sie eine einzelne Zelle des Wirtsprotisten mit einem neuen Kapillarröhrchen.
9. Ersetzen Sie den Deckel der Petrischale auf der Bühne durch den Deckel mit 1% NP-40.
Tauchen Sie die Spitze des 15 mm Durchmesser Kapillars in den 1% NP-40 Tropfen und passen Sie den Druck im Inneren der Kapillare mit dem Cell Tram Vario an. Achten Sie darauf, 1% NP-40 nicht vollständig aus der Kapillare zu drücken. Blasen machen das Phasenkontrastbild unklar.
Tauchen Sie die Spitze des 30–100 mm Durchmesser Kapillars nahe der Spitze des 15-mm Durchmesser Kapillars in den 1% NP-40 Tropfen und lassen Sie die Wirtsprotisten-Zelle vorsichtig los.
12. Sammeln Sie so viele Bakterienzellen wie möglich mit einem Kapillarröhrchen mit 15 mm Durchmesser.
13. Geben Sie die gesammelten Zellen in LB in das PCR-Röhrchen frei.

Whole-Genome-Amplifikation

1. Inkubieren Sie die gesammelten Bakterienzellen 10 Minuten lang in 1× LB auf Eis oder in einem PCR-Kühler.
2. Bereiten Sie die negative Kontrollreaktion parallel zur Probenreaktion vor und führen Sie sie durch.
3. Fügen Sie 1,0 ml NB und 22 ml Probenpuffer hinzu und mischen Sie kurz.
4. Bereiten Sie die Reaktionsmischung vor: Mischen Sie 2,5 ml Enzymlösung und 22,5 ml Reaktionspuffer durch Pipettieren.
5. Fügen Sie das Reaktionsgemisch zur Probenmischung hinzu.
6. Inkubieren Sie bei 30 °C für 2,5 Stunden.
7. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie sie 10 Minuten bei 65 °C inkubieren.
8. Überprüfen Sie die Amplifikation durch Agarose-Gelelektrophorese.
9. Reinigen Sie DNA durch Ethanolfällung.
10. Lösen Sie das Präzipitat in 50 ml TE auf.
11. Messen Sie die DNA-Konzentration.

Überprüfung der Reinheit der Probe

1. Bereiten Sie eine 1:200 Verdünnung der gereinigten WGA-Probe, die in TE gelöst ist, und der negativen Kontrollreaktion ohne Reinigung vor. Verwenden Sie 1/10 des Volumens als Vorlage für die folgende PCR.
2. Führen Sie eine PCR mit spezifischen Primer-Sets für eubakterielle, archaeale und eukaryotische SSU rRNA-Gene sowie für spezifische Protein-kodierende Gene wie hsp60 und gyrB durch. Führen Sie immer das Negativkontrollexperiment für die PCR durch. PCR-Bedingungen: 95°C 30 s, 25 Zyklen von (95°C 10 s, 50°C 30 s, 72°C 2 min), 72°C 4 min.
3. Wenn es keine PCR-Amplifikation aus der negativen Kontrollprobe weder für WGA noch für PCR gibt und nur PCRs mit bakterien-spezifischen Primern Produkte aus der WGA-Probe erzeugen, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
4. Führen Sie die PCR-Amplifikation von eubakteriellen 16S rRNA-Genen mit einer korrekturlesenden DNA-Polymerase durch.
5. Klonen und sequenzieren Sie die PCR-Produkte mit standardmäßigen Methoden.
6. Überprüfen Sie, ob die Genome der Zielbakterienart in der Probe vorherrschen, und bewerten Sie auch die Variationen innerhalb der Art des Zielbakteriums.

Genomsequenzierung

Nach der Reinheitsprüfung der WGA-Probe bereiten Sie eine Bibliothek für den Illumina-Sequenzer vor.

Referenz:

1. Hongoh Y, Toyoda A. Whole-Genome-Sequenzierung eines unculturierbaren Bakteriums mittels Whole-Genome-Amplifikation[M]//Hochdurchsatz-Nächste-Generation-Sequenzierung. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 25-33.