Richtlinien zur Einreichung von Proben
LncRNA-Sequenzierung Fragen und Antworten
Allgemeine Fragen
- Was ist Ihre Strategie zum Aufbau von Bibliotheken und zur Sequenzierung des LncRNA-Transkriptoms?
- Extrahieren Sie die gesamte RNA der Probe, entfernen Sie die ribosomale RNA und erstellen Sie eine strangspezifische Bibliothek, d.h. eine lncRNA-Bibliothek. Basierend auf der Illumina NoveSeq 6000 Plattform wird eine doppelseitige PE250-Sequenzierung durchgeführt.
Sequenzierung: Da die lncRNA Die Bibliothek enthält Informationen zu mRNA und lncRNA, und die Häufigkeit von lncRNA ist gering. Das empfohlene Datenvolumen beträgt 10-12G Rohdaten pro Probe für Säugetiere wie Mensch, Ratte und Maus.
- Extrahieren Sie die gesamte RNA der Probe, entfernen Sie die ribosomale RNA und erstellen Sie eine strangspezifische Bibliothek, d.h. eine lncRNA-Bibliothek. Basierend auf der Illumina NoveSeq 6000 Plattform wird eine doppelseitige PE250-Sequenzierung durchgeführt.
- Warum sollte rRNA bei der lncRNA-Sequenzierung und Bibliothekskonstruktion entfernt werden?
- Nur das 3'-Ende von lncRNA trägt eine PolyA-Struktur, andere lncRNAs haben keine PolyA-Struktur, daher wird die Anreicherung mit Oligo(dT)-Magnetperlen nicht empfohlen, um umfassendere lncRNA-Informationen zu erhalten.
- Was sind die Artenanforderungen für lncRNA-Sequenzierung?
- • Die Art hat ein Referenzgenom, das mindestens bis zur Gerüstebene gespleißt ist.
• Eine umfassendere Anmerkung ist verfügbar.
- • Die Art hat ein Referenzgenom, das mindestens bis zur Gerüstebene gespleißt ist.
- Wie man Zielgene von lncRNA vorhersagt?
- LncRNA kann Zielgene durch Ko-Lokalisierung und Ko-Expression als regulatorische RNA regulieren. Die Vorhersage von Zielgenen durch Ko-Lokalisierung basiert auf dem Prinzip, dass die Funktion von lncRNA mit den nahegelegenen protein-codierenden Genen in Verbindung steht, sodass die protein-codierenden Gene in der Nähe von lncRNA als ihre Zielgene ausgewählt werden. Das Prinzip der Vorhersage von Zielgenen durch Ko-Expression legt nahe, dass die Funktion von lncRNA nicht mit der Position des kodierenden Gens, sondern mit seinem ko-exprimierten protein-codierenden Gen verbunden ist. Die Zielgene können durch Korrelationsanalysen oder Ko-Expressionsanalysen zwischen der Expression von lncRNAs und protein-codierenden Genen in verschiedenen Proben vorhergesagt werden.
- Wie kann man erklären, dass die vorhergesagten partiellen lncRNA-Sequenzen mit den mRNA-Sequenzen übereinstimmen?
- • Die lncRNA des Sense-Strangs wurde nicht aus der Datenbank entfernt, die lncRNA des Sense-Typs überlappt bis zu einem gewissen Grad mit mRNA.
• Wenn die Positionen der lncRNA und mRNA genau gleich sind, müssen wir berücksichtigen, ob sie sich jeweils auf den positiven und negativen Strängen befinden. LncRNA und mRNA können in unterschiedlichen Strängen existieren, aber die Basen sind vollständig komplementär.
- • Die lncRNA des Sense-Strangs wurde nicht aus der Datenbank entfernt, die lncRNA des Sense-Typs überlappt bis zu einem gewissen Grad mit mRNA.
- Wie man lncRNA beim Analysieren von Sequenzierungsdaten screenen kann?
- 1. Fügen Sie Transkripte zusammen, die durch das Zusammenfügen aller Proben mit der Software cuffcompare erhalten wurden, und wählen Sie Transkripte aus, die von beiden Splicing-Software identifiziert werden oder in mindestens zwei Proben gleichzeitig erscheinen.
2. Wählen Sie Transkripte ≥ 200 bp aus.
3. Screen-Transkripte nach ihren FPKM-Werten.
4. Wenn bekannte lncRNA-Daten für die Art vorhanden sind, werden die in dem vorherigen Schritt erhaltenen Transkripte zunächst mit den bekannten lncRNAs mithilfe von cuffcompare verglichen, um Transkripte zu erhalten, die identisch mit den bekannten lncRNAs sind. Dieser Anteil an Transkripten wurde direkt in das endgültige lncRNA-Set ohne weitere Überprüfung aufgenommen. Danach werden diejenigen Transkripte, die den oben genannten bekannten Transkripten ähnlich oder identisch sind, durch den Vergleich mit Transkripten bekannter Nicht-lncRNA- und Nicht-mRNA-Typen (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, pre-miRNA, Pseudogene, usw.) der Art. Wenn keine bekannten lncRNA-Daten verfügbar sind, wird ein direkter Vergleich mit bekannten nicht-lncRNA- und nicht-mRNA-Transkripten der Art durchgeführt.
5. Screenen Sie Kandidaten für lincRNA, intronische lncRNA, anti-sense lncRNA und andere Typen für eine anschließende quantitative Analyse, indem Sie diese mit bekanntem mRNA vergleichen und die Informationen aus den Ergebnissen der cuffcompare-Analyse verwenden.
- 1. Fügen Sie Transkripte zusammen, die durch das Zusammenfügen aller Proben mit der Software cuffcompare erhalten wurden, und wählen Sie Transkripte aus, die von beiden Splicing-Software identifiziert werden oder in mindestens zwei Proben gleichzeitig erscheinen.
- Welche Validierungsexperimente können nach der lncRNA-Sequenzierung durchgeführt werden?
- • Ausdrucksüberprüfung: Überprüfen Sie das Ausdrucksniveau von differentiellen Genen durch Fluoreszenzquantifizierung, ob es mit den Sequenzierungsergebnissen übereinstimmt.
• In-situ-Hybridisierung (FISH)
• Funktionsverlustexperiment: Silencing von lncRNA mittels siRNA, shRNA, Antisense-Nukleinsäuren und anderen Methoden, um die Auswirkungen der Intervention auf den zellulären Mehrwert, Apoptose, Invasion, Metastase, Chromosomen usw. zu beobachten und die Expression der Zielgene von lncRNA zu verifizieren.
• Funktionelles Erwerbsexperiment: Konstruktion eines lncRNA-Überexpressionsvektors, Beobachtung der Auswirkungen auf Zellproliferation, Apoptose, Invasion usw. nach der Überexpression von lncRNA und Verifizierung der Expressionshäufigkeit von lncRNA-Zielgenen.
• Überexpressions- oder Knockdown-Experimente: Wenn lncRNA im Zellkern lokalisiert ist und das Expressionsniveau der vorhergesagten Zielgene nach der Deletion erhöht ist, wird spekuliert, dass lncRNA an Transkriptionsfaktoren (Proteine) binden könnte, um die DNA-Transkription zu hemmen; oder wenn lncRNA im Zytoplasma lokalisiert ist und Überexpressions- oder Deletionsversuche zeigen, dass einige Proteinaktivitäten erhöht oder reduziert sind, wird spekuliert, dass lncRNA an einige Proteine binden und ihre Wirkungen entfalten könnte.
- • Ausdrucksüberprüfung: Überprüfen Sie das Ausdrucksniveau von differentiellen Genen durch Fluoreszenzquantifizierung, ob es mit den Sequenzierungsergebnissen übereinstimmt.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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