B-Zell-Rezeptor-Sequenzierung mit Molekularbarcodes-Protokoll

RNA-Extraktion

1. Zellensammlung: Übertragen Sie die Zellen in ein geeignetes Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 ×g. Entfernen Sie den Überstand.
2. Homogenisieren und lysieren Sie die Probe, indem Sie 350 μL Puffer LBP zu dem Zellpellet hinzufügen. Das Mischen der Zellen mit einem Lysepuffer ist in der Regel ausreichend für eine vollständige Lyse.
3. Entfernen von gDNA und Filtrieren des Lysats: Platzieren Sie die NucleoSpin® gDNA Removal Column (gelber Ring) in ein 2 mL Sammlungsglas, übertragen Sie das homogenisierte Lysat in die NucleoSpin® gDNA Removal Column und zentrifugieren Sie es 30 Sekunden lang bei 11.000 × g. Entsorgen Sie die Säule und fahren Sie mit dem Durchfluss fort.
4. Passen Sie die RNA-Bindungsbedingungen an: Fügen Sie 100 μL Bindungslösung BS zum Durchfluss hinzu und mischen Sie gut durch moderates Vortexen oder mehrmaliges Pipettieren auf und ab. Nach der Zugabe der Bindungslösung BS kann ein faseriger Niederschlag sichtbar werden, der die RNA-Isolation nicht beeinträchtigt. Stellen Sie sicher, dass Sie den Niederschlag durch Mischen auflockern und laden Sie den gesamten Niederschlag wie im folgenden Schritt beschrieben auf die Säule. Zentrifugieren Sie das Lysat nach der Zugabe der Bindungslösung nicht, bevor Sie es auf die Säule laden, um zu vermeiden, dass der Niederschlag pelletiert wird.
5. Bind RNA: Übertragen Sie den gesamten Lysat (~450 μL) in die NucleoSpin® RNA Plus Säule (hellblauer Ring), die mit einem Auffangrohr vorgefertigt ist. Zentrifugieren Sie 15 Sekunden bei 11.000 × g.
6. Silikagelmembran waschen und trocknen:
(a) Erste Waschung: Fügen Sie 200 μL Puffer WB1 zur NucleoSpin® RNA Plus Säule hinzu. Zentrifugieren Sie 15 s bei 11.000 × g. Entsorgen Sie den Durchfluss mit dem Auffangrohr und setzen Sie die Säule in ein neues 2 mL Auffangrohr.
(b) Zweite Waschung: Fügen Sie 600 μL Puffer WB2 zur NucleoSpin® RNA Plus Säule hinzu. Zentrifugieren Sie 15 s bei 11.000 × g. Entfernen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Säule wieder in das Auffangrohr.
(c) Dritte Wäsche: Fügen Sie 250 μL Puffer WB2 zur NucleoSpin® RNA Plus Säule hinzu. Zentrifugieren Sie 2 Minuten bei 11.000 × g, um die Membran vollständig zu trocknen. Platzieren Sie die Säule in ein nukleasefreies 1,5 mL Sammlungsglas.
7. RNA eluieren: Fügen Sie 30 μL RNase-freies H2O hinzu und zentrifugieren Sie bei 11.000 × g für 1 Minute. Fügen Sie weitere 30 μL RNase-freies H2O zur Säule hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei 11.000 × g für 1 Minute.
8. Nach der RNA-Extraktion, wenn die Probenmenge nicht begrenzend ist, empfehlen wir, die Gesamt-RNA-Qualität mit dem Agilent RNA 6000 Pico Kit oder einer gleichwertigen Plattform zu bewerten. Bitte beachten Sie die Anweisungen des Herstellers.

Erste-Strang cDNA-Synthese

1. Tauchen Sie den First-Strand-Puffer bei Raumtemperatur auf. Tauchen Sie den BCR-Enhancer, die SMART-Molekularbarcode-Oligos und den dT-Primer auf Eis auf. Mischen Sie jedes Reagenz vorsichtig durch Vortexen und zentrifugieren Sie kurz. Lagern Sie alle Reagenzien außer dem First-Strand-Puffer auf Eis. Nehmen Sie die SMARTScribe-Reverse-Transkriptase und den RNase-Inhibitor unmittelbar vor der Verwendung aus dem Gefrierschrank, zentrifugieren Sie kurz und lagern Sie sie auf Eis.
2. Heizen Sie den Thermocycler auf 72 °C vor.
3. Bereiten Sie auf Eis Proben und Kontrollen in nucleasefreien PCR-Röhrchen mit dünnen Wänden, Platten oder Streifen vor, indem Sie die Reagenzien hinzufügen.
4. Mischen Sie durch sanftes Vortexen und zentrifugieren Sie dann kurz.
5. Inkubieren Sie die Röhrchen 3 Minuten lang bei 72 °C im vorgeheizten Thermocycler mit beheiztem Deckel. Bereiten Sie während dieser Inkubation die RT-Mastermix vor.
6. Bereiten Sie bei Raumtemperatur den RT-Mastermix vor.
7. Mischen Sie den RT Master Mix gut, indem Sie vorsichtig auf- und abpipettieren, und zentrifugieren Sie dann kurz.
8. Unmittelbar nach der 3-minütigen Inkubation bei 72 °C die Proben für 2 Minuten auf Eis legen.
Reduzieren Sie die Temperatur des Thermocyclers auf 42 °C.
Fügen Sie 7,5 μL des RT Master Mix zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu. Mischen Sie den Inhalt jedes Röhrchens durch sanftes Pipettieren und zentrifugieren Sie kurz.
11. Platzieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel, der auf 42 °C vorgeheizt ist. Führen Sie das folgende Programm aus: 42 °C, 90 min; 70 °C, 10 s; 4 °C Halt.

Erste Runde Verstärkung

1. Tauchen Sie 5× PrimeSTAR GXL-Puffer, dNTP-Mix, Primer und nukleasefreies Wasser auf Eis auf. Vortexen Sie jedes Reagenz vorsichtig, um es zu mischen, und zentrifugieren Sie kurz. Auf Eis lagern. Nehmen Sie die PrimeSTAR GXL DNA-Polymerase unmittelbar vor der Verwendung aus dem Gefrierschrank, pipettieren Sie vorsichtig, um sie zu mischen, zentrifugieren Sie kurz und lagern Sie sie auf Eis.
2. Bereiten Sie einen PCR1-Mastermix für jede IgG/IgM/IgK/IgL-Kette von Interesse vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge auf Eis kombinieren. Sanft vortexen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.
Fügen Sie 46 μL des entsprechenden IgG/IgM/IgK/IgL PCR1 Master Mix zu einer nucleasefreien, dünnwandigen 0,2-mL PCR-Platte/-röhrchen hinzu.
Fügen Sie 4 μL des ersten cDNA-Strangs aus Abschnitt 3.3 zu den entsprechenden Röhrchen mit dem PCR1-Mastermix hinzu. Sanft vortexen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.
5. Legen Sie die Platte/die Röhrchen in einen vorgeheizten Thermocycler mit beheiztem Deckel und führen Sie das folgende Programm aus (Deckeltemperatur: 105 °C): 95 °C 1 min; 98 °C 10 s, 60 °C 15 s und 68 °C 45 s (18 Zyklen); 4 °C Haltezeit.

Zweite PCR-Amplifikation

1. Tauchen Sie 5X PrimeSTAR GXL-Puffer, dNTP-Mix, Primer und nukleasefreies Wasser auf Eis auf. Mischen Sie jedes Reagenz vorsichtig durch Vortexen und zentrifugieren Sie kurz. Lagern Sie es auf Eis. Nehmen Sie die PrimeSTAR GXL DNA-Polymerase unmittelbar vor der Verwendung aus dem Gefrierschrank, pipettieren Sie vorsichtig zur Durchmischung, zentrifugieren Sie kurz und lagern Sie sie auf Eis.
2. Für jede IgG/IgM/IgK/IgL-Kette von Interesse bereiten Sie einen PCR2-Mastermix vor, indem Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge auf Eis kombinieren. Sanft vortexen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.
3. Für jede Reaktion 48 μL PCR2 Master Mix zu einer nucleasefreien, dünnwandigen 0,2-mL PCR-Platte/-röhrchen hinzufügen.
4. Fügen Sie 1 μL des entsprechenden PCR1-Produkts zu jedem entsprechenden PCR2-Röhrchen hinzu.
5. Fügen Sie 1 μL des entsprechenden hBCR PCR2 Universal Forward 1–12 Primers zu jeder Probe hinzu. Sanft vortexen, um zu mischen, und kurz zentrifugieren.
6. Platzieren Sie die Platte/die Röhrchen in einem vorgeheizten Thermocycler mit beheiztem Deckel und führen Sie das folgende Programm aus (Deckeltemperatur: 105 °C): 95 °C 1 min; 98 °C 10 s, 60 °C 15 s, 68 °C 45 s (X* Zyklen); 4 °C Halt.

Reinigung von amplifizierten Bibliotheken

1. Vortexieren Sie die NucleoMag-Perlen, bis sie gleichmäßig gemischt sind, und fügen Sie dann 25 μL der NucleoMag-Perlen zu jeder Probe hinzu.
2. Mischen Sie gründlich, indem Sie das gesamte Volumen sanft mindestens zehnmal auf- und abpipettieren.
3. Bei Raumtemperatur 8 Minuten inkubieren, damit die DNA an die Perlen bindet.
4. Drehen Sie die Proben kurz, um die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens oder der Probenvertiefung zu sammeln. Stellen Sie die Proben für ca. 5 Minuten oder länger auf das magnetische Trenngerät, bis die Flüssigkeit vollständig klar erscheint und keine Perlen mehr im Überstand vorhanden sind. Die benötigte Zeit, bis die Lösung klar ist, hängt von der Stärke des Magneten ab.
5. Während die Reaktionsröhrchen auf dem magnetischen Trenngerät stehen, verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand (der Ihre Bibliothek enthält) in saubere PCR-Röhrchen zu übertragen.
6. Entfernen Sie die Röhrchen mit den Perlen aus dem magnetischen Trenngerät und entsorgen Sie sie.
7. Fügen Sie 10 μL NucleoMag-Perlen zu jedem Rohr mit Überstand hinzu.
8. Mischen Sie gründlich, indem Sie das gesamte Volumen mindestens zehnmal vorsichtig auf- und abpipettieren.
9. Bei Raumtemperatur 8 Minuten inkubieren, damit die DNA an die Perlen bindet.
10. Stellen Sie die Röhrchen für ca. 10 Minuten auf das magnetische Trenngerät oder bis die Lösung vollständig klar ist.
11. Während die Röhrchen auf dem magnetischen Trenngerät stehen, entfernen Sie das Überstand mit einer Pipette und entsorgen Sie es.
12. Lassen Sie die Röhrchen am Gerät zur magnetischen Trennung. Fügen Sie 200 μL frisch hergestellten 80%igen Ethanol zu jeder Probe hinzu, ohne die Perlen zu stören, um Verunreinigungen zu entfernen. Warten Sie 30 Sekunden und verwenden Sie eine Pipette, um vorsichtig das Überstand mit den Verunreinigungen zu entfernen. Die Bibliothek bleibt während des Waschvorgangs an den Perlen gebunden.
Wiederholen Sie die Ethanolwäsche (Schritt 12 dieses Abschnitts) ein weiteres Mal.
14. Drehen Sie die Röhrchen kurz (~2000 × g), um die verbleibende Flüssigkeit am Boden jedes Röhrchens zu sammeln. Stellen Sie die Röhrchen für 30 Sekunden auf das magnetische Trenngerät und entfernen Sie dann die gesamte verbleibende Flüssigkeit mit einer Pipette.
15. Lassen Sie die Probenröhrchen etwa 2–2,5 Minuten bei Raumtemperatur offen auf dem Magnettrenngerät ruhen, bis das Pellet trocken erscheint und nicht mehr glänzt. Möglicherweise sehen Sie einen kleinen Riss im Pellet.
16. Sobald das Perlenpellet getrocknet ist, entfernen Sie die Röhrchen aus dem magnetischen Trenngerät und fügen Sie 17 μL Elutionspuffer hinzu, um das Pellet zu bedecken. Mischen Sie gründlich, indem Sie auf und ab pipettieren, um eine vollständige Dispersion der Perlen sicherzustellen.
17. Bei Raumtemperatur mindestens 5 Minuten inkubieren, um zu rehydrieren.
18. Drehen Sie die Proben kurz, um die Flüssigkeit von der Seite des Röhrchens oder der Probenvertiefung zu sammeln. Stellen Sie die Proben für 2 Minuten oder länger zurück auf das magnetische Trenngerät, bis die Lösung vollständig klar ist.
19. Übertragen Sie das klare Überstand mit der gereinigten BCR/IG-Bibliothek aus jedem Röhrchen in ein nukleasefreies, niedrig haftendes Röhrchen. Beschriften Sie jedes Röhrchen mit den Probeninformationen und lagern Sie es bei −20 °C.

Sequenzierung

1. Verdünnen Sie jede Bibliothek auf 4 nM in nukleasefreiem Wasser. Um Pipettierfehler zu vermeiden, verwenden Sie mindestens 2 μL jeder ursprünglichen Bibliothek zur Verdünnung.
2. Kombinieren Sie die verdünnten Bibliotheken, indem Sie eine gleiche Menge jeder Bibliothek in einem 1,5-mL-Röhrchen mit niedriger Bindung zusammenführen. Mischen Sie durch Vortexen bei niedriger Geschwindigkeit oder durch Pipettieren nach oben und unten. Verwenden Sie mindestens 2 μL jeder verdünnten Bibliothek, um Pipettierfehler zu vermeiden.
3. Verwenden Sie ein 5 μL-Alikot der 4-nM-konzentrierten gepoolten Bibliotheken. Befolgen Sie das Protokoll zur Denaturierung der Bibliotheken gemäß der neuesten Ausgabe des Benutzerhandbuchs Ihres Illumina-Sequenzierungsgeräts.

Referenz:

1. Gupta N, Marquez S, Soto C, et al. Bulk-Sequenzierung von mRNA mit molekularen Barcodes zur Bewertung von B-Zell-Isotypen und klonaler Evolution: Eine Methode der AIRR-Community[M]//Immunogenetik. Humana, New York, NY, 2022: 345-377.