Isolation von viraler RNA für das Protokoll der Next-Generation-Sequenzierung

Teilweise Reinigung von RNA-Viren

1. Geben Sie 25 ml des mit IBV infizierten Allantoisflüssigkeit in ein 50 ml Falcon-Röhrchen und zentrifugieren Sie es 10 Minuten lang bei 1.150 × g, 4 °C in einer Tischzentrifuge.
2. Nehmen Sie das Überstand und schichten Sie es auf 10 ml 30 % Saccharose in einem Ultrazentrifugenröhrchen. Balancieren Sie die Röhrchen sorgfältig.
Zentrifugieren Sie 4 Stunden bei 102.400 × g, 4 °C in einer Ultrazentrifuge.
4. Entfernen Sie das Überstand in Schichten, wobei Sie darauf achten, das Pellet nicht zu stören.
5. Wischen Sie die Seiten des Röhrchens mit einem Tuch ab und fahren Sie direkt mit dem nächsten Schritt, der RNA-Extraktion, fort.

RNA-Extraktion

1. Fügen Sie 1 ml TRIzol-Reagenz direkt zum Viruspellet hinzu und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um zu mischen.
2. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
3. Fügen Sie 200 μl Chloroform hinzu und mischen Sie durch Schütteln für 15 Sekunden.
4. 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
5. Zentrifugieren Sie in einer Tischzentrifuge für 15 Minuten bei 4 °C und 12.075 × g.
6. Nehmen Sie vorsichtig die wässrige obere Schicht, die klar sein sollte, und geben Sie sie in ein sauberes 1,5 ml Röhrchen.
7. Fügen Sie 0,5 ml Isopropanol hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
8. Zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 2.100 × g, 4 °C in einer Tischzentrifuge.
9. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
Fügen Sie 0,75 m 75 % Ethanol zu dem Pellet hinzu und mischen Sie es durch Pipettieren.
11. Zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 12.075 × g, 4 °C in einer Tischzentrifuge.
12. Entfernen Sie das Überstand sehr vorsichtig und wischen Sie die Seiten des Röhrchens mit einem Tuch ab.
13. Lassen Sie das Pellet 5–10 Minuten an der Luft trocknen.
14. Resuspendieren Sie das Pellet in 25 μl RNAse-freiem sterilen Wasser und lagern Sie es bei −20 oder −80 °C.