Richtlinien zur Einreichung von Proben
Transkriptomik Q&A
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Allgemeine Fragen
- Welche Arten von Transkriptom-Sequenzierung können gewählt werden?
- (1) Je nach Art der RNA
Es gibt mRNA-Sequenzierung, SmallRNA-Sequenzierung, LncRNA-Sequenzierung, CircRNA-Sequenzierung, Ganztranskriptom-Sequenzierung usw.
(2) Nach den Artmerkmalen
Zum Beispiel Eukaryoten oder Prokaryoten, ob es ein Referenzgenom gibt, verschiedene Sequenzierungsplattformen, eukaryotische Transkriptom-Sequenzierung mit und ohne Referenz, prokaryotische Transkriptom-Sequenzierung, Voll-Längen-Transkriptom-Sequenzierung usw.
- (1) Je nach Art der RNA
- Wie wählt man die Datenvolumengröße für die Transkriptom-Sequenzierung aus?
- Die Menge an Daten, die für die transkriptionelle regulatorische Sequenzierung erforderlich ist, variiert je nach Art des Projekts, und die Datenmenge steht auch im Zusammenhang mit der Genomgröße und -komplexität.
Um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Ergebnisse der Datenanalyse sicherzustellen, wird für die Illumina-Plattform und die PacBio-Plattform ein Datenvolumen von 6 Gb für die Sequenzierung des eukaryotischen Transkriptoms für die anschließende Analyse empfohlen, und ein Datenvolumen von 8-10 Gb wird empfohlen.
Wenn Sie Transkripte mit niedrigerer Häufigkeit nachweisen möchten, wird für das prokaryotische Transkriptom ein Datenvolumen von 4 Gb für die anschließende Analyse empfohlen. Bei einigen Genen mit einer hohen Anzahl von Arten, die von geringerer Genexpressionshäufigkeit betroffen sind, sowie bei Pathogen-Wirt-Interaktionen kann das Datenvolumen je nach Situation angemessen erhöht werden.
- Die Menge an Daten, die für die transkriptionelle regulatorische Sequenzierung erforderlich ist, variiert je nach Art des Projekts, und die Datenmenge steht auch im Zusammenhang mit der Genomgröße und -komplexität.
- Was ist der Unterschied zwischen prokaryotischen und eukaryotischen Transkriptom-Bibliotheken?
- Eukaryotische mRNA hat einen Poly-A-Schwanz und kann durch Poly-dT angereichert werden. Darüber hinaus sind eukaryotische Genome normalerweise größer und haben in der Regel nur Gene auf dem positiven Strang, sodass der Aufbau eukaryotischer Bibliotheken durch Poly-A-Anreicherung erfolgen kann.
Prokaryotische Genome haben eine höhere Nutzungsrate und es existieren mehr Gene sowohl auf dem positiven als auch auf dem negativen Strang. Daher müssen wir zwischen Informationen des positiven und negativen Strangs beim Aufbau von prokaryotischen Bibliotheken unterscheiden. Unsere Methode zum Aufbau prokaryotischer Bibliotheken ist der ribosomale strangspezifische Bibliotheksaufbau.
- Eukaryotische mRNA hat einen Poly-A-Schwanz und kann durch Poly-dT angereichert werden. Darüber hinaus sind eukaryotische Genome normalerweise größer und haben in der Regel nur Gene auf dem positiven Strang, sodass der Aufbau eukaryotischer Bibliotheken durch Poly-A-Anreicherung erfolgen kann.
- mRNA-Transkriptom-Routine-Bibliotheksaufbauprozess?
- 1. Extraktion von totaler RNA aus der Probe
2. Oligo(dT) magnetische Perlenanreicherung von RNA mit Poly-A-Struktur am 3'-Ende
3. Rücktranskription und Erstellung einer cDNA-Bibliothek
4. PCR
5. Doppelendige PE250-Sequenzierung basierend auf der Illumina NoveSeq 6000 Plattform
- 1. Extraktion von totaler RNA aus der Probe
- Was ist die Beziehung zwischen Transkriptom-Sequenzierung und DEG (digitale Genexpression)?
- Die Hauptunterschiede zwischen Transkriptom und DEG sind die Sequenzierungsstrategie, das Datenvolumen und die Datenanalyse. Die Transkriptom-Sequenzierung hat ein größeres Datenvolumen und ermöglicht neben der Analyse von unterschiedlich exprimierten Genen auch die Analyse der Genstruktur. Im Gegensatz dazu ist das Datenvolumen der DEG-Sequenzierung klein, was im Allgemeinen bedeutet, dass es die Analyse der differentiell exprimierten Gene erfüllen kann, jedoch keine Genstruktur-Analyse durchführen kann.
- Erfordert die Transkriptom-Sequenzierung biologische Replikate?
- Einzelne Organismen sind sehr unterschiedlich, und wenn die Stichprobengröße klein ist, sind die erhaltenen differentiell exprimierten Gene wahrscheinlich nur Ausdruck einiger individueller Unterschiede und spiegeln nicht die wesentlichen Merkmale einer Krankheit oder eines bestimmten physiologischen Zustands der Population wider.
Für Pflanzen- und Tierproben werden mehr als 5 biologische Replikate empfohlen, um Korrelationsanalysen zwischen biologischen Proben durchzuführen und die Glaubwürdigkeit der experimentellen Ergebnisse zu verbessern.
Für Zellproben ist die Variabilität zwischen biologischen Replikaten relativ gering, und mehr als 3 biologische Replikate werden empfohlen.
Für Proben klinischer Studien sind aufgrund möglicher Unterschiede im Genotyp, Lebensstil, Lebensumfeld, Alter und Geschlecht der Spender mehr biologische Replikate erforderlich, und in der Regel sind mehr als 10 biologische Replikate notwendig.
- Einzelne Organismen sind sehr unterschiedlich, und wenn die Stichprobengröße klein ist, sind die erhaltenen differentiell exprimierten Gene wahrscheinlich nur Ausdruck einiger individueller Unterschiede und spiegeln nicht die wesentlichen Merkmale einer Krankheit oder eines bestimmten physiologischen Zustands der Population wider.
- Beim Sequenzieren des eukaryotischen Transkriptoms werden mitochondriale und chloroplastische RNA nachgewiesen?
- Normalerweise nicht, da mitochondriale und chloroplastäre RNAs keine Poly-A-Schwänze haben.
- Kann ich eine prokaryotische Transkriptomanalyse oder eine referenzfreie Transkriptomanalyse durchführen, wenn die Art kein Referenzgenom hat?
- Nein, das wird nicht empfohlen. Das Prokaryoten-Transkriptom benötigt ein Referenzgenom, da mRNAs von Prokaryoten in der Regel multiple cis-trans sind und direktes Spleißen weniger effektiv ist und einen großen Einfluss auf die nachfolgende Datenanalyse hat.
- Sollte ich im Falle eines schlechten Referenzgenoms die Transkriptom-Sequenzierung ohne oder mit Referenz wählen?
- Sofern das Referenzgenom verfügbar ist, wird empfohlen, das Referenzgenom für die Analyse zu verwenden. Der schwierigere Teil beim Genomsplicing sind die Wiederholungsregionen, und die schlechte Qualität der Genassemblierung ist hauptsächlich auf die Wiederholungssequenzen zurückzuführen. Die Sequenzen der kodierenden Regionen des Genoms lassen sich relativ leicht splicen, da sie eine gute Heterozygosität oder Wiederholbarkeit aufweisen. Die Assemblierungsqualität der kodierenden Region ist im Allgemeinen besser. Daher wird das Referenzgenom bevorzugt verwendet.
- Welche Faktoren beeinflussen die Ergebnisse der Transkriptom-Sequenzierung?
- Die Degradation von RNA beeinträchtigt erheblich die Qualität der Sequenzierung. Nach der RNA-Degradation kann die gereinigte mRNA nach dem Hinzufügen von Poly-A nicht erfasst werden, daher kann die Reverse-Transkription mit zufälligen Primern nicht alle cDNAs erhalten, was zu einer offensichtlichen 3'- und 5'-Bias der Sequenzierungsergebnisse führt. Das Vorhandensein von Poly-A-Polymorphismen in der Bibliothek kann das Sequenzierungssignal stören und die Genauigkeit der Sequenzierungsergebnisse beeinträchtigen; gleichzeitig müssen die Proben aufgrund der inkonsistenten Häufigkeit von Transkripten im Transkriptom vor dem Experiment homogenisiert werden, da sonst die hoch-abundant exprimierten Gene die niedrig-abundant exprimierten Gene überdecken, was dazu führt, dass neue Gene nicht gefunden werden oder eine große Anzahl bedeutungsloser Duplikatsequenzen erhalten wird.
- Warum muss ich eine strangspezifische Bibliothek erstellen?
- Viele Gene haben positive und negative RNA-Transkripte im Genom, und die Antisense-Transkription ist ein Merkmal eukaryotischer Gene und eine wichtige Regulierungsmethode. Die Verwendung von strangspezifischen Bibliotheken bewahrt die Richtungsinformation der RNA und ermöglicht es uns zu bestimmen, ob die Transkripte von positiven oder negativen Strängen stammen, was uns genauere Ergebnisse zur Gencharakterisierung und Informationen zur Genexpression liefert.
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Probenvorbereitung
- Muss ich meine Zellprobe nach dem Hinzufügen von Trizol zur RNA-Extraktion schockgefrieren?
- Trizol ist ein Reagenz zur Extraktion von totaler RNA direkt aus Zellen oder Geweben. Trizol bewahrt die Integrität der RNA während der Probenlyse oder Homogenisierung; um die Integrität der RNA sicherzustellen, muss sie in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bei -80°C eingefroren werden (für die Langzeitlagerung).
- Sind 20 mg Fettgewebe ausreichend für das Transkriptom?
- Adipöses Gewebe ist eine Gewebeprobe mit niedrigem Nukleinsäuregehalt und niedriger RNA-Ausbeute. Unter normalen Umständen kann aus 1 mg adipösem Gewebe nur 0-0,05 μg RNA extrahiert werden, 20 mg Probe können höchstens 1 μg RNA liefern, wenn die Probe in gutem Zustand ist und die Extraktionsverluste nicht berücksichtigt werden, während normalerweise 2 μg RNA für die Transkriptom-Sequenzierung benötigt werden. Es wird empfohlen, mehr Proben zu senden, vorzugsweise über 50 mg.
- Welche Vorsichtsmaßnahmen sind während der Lieferung von Blutproben für die Transkriptom-Sequenzierung zu treffen?
- Es wird empfohlen, EDTA-Antikoagulationstuben für Vollblutproben zu verwenden, oder Natriumcitrat-Antikoagulationstuben sind ebenfalls akzeptabel. Blutkörperchen können ebenfalls zentrifugiert werden, aber sowohl Vollblut als auch Blutkörperchen müssen mit Trizol behandelt werden. Nach dem Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff bei -80 °C lagern und auf Trockeneis transportieren.
Für menschliches Vollblut wird empfohlen, PAXgene-Röhrchen zur Entnahme zu verwenden, die 3 Tage bei 18-25°C, 5 Tage bei 2-8°C und 8 Jahre bei -20 bis -80°C gelagert werden können. Grundsätzlich sind -80°C Lagerung und Transport mit Trockeneis erforderlich.
- Es wird empfohlen, EDTA-Antikoagulationstuben für Vollblutproben zu verwenden, oder Natriumcitrat-Antikoagulationstuben sind ebenfalls akzeptabel. Blutkörperchen können ebenfalls zentrifugiert werden, aber sowohl Vollblut als auch Blutkörperchen müssen mit Trizol behandelt werden. Nach dem Schnelleinfrieren in flüssigem Stickstoff bei -80 °C lagern und auf Trockeneis transportieren.
- Worauf muss ich bei der Entnahme frischer Gewebeproben achten?
- Nachdem frische Gewebeproben isoliert wurden, werden endogene RNA-Enzyme in den Proben RNA in kurzer Zeit schnell abbauen, und Apoptose wird ebenfalls die Expression der Transkriptionsniveaus in frischen Gewebeproben beeinflussen. Daher wird empfohlen, frische Gewebeproben kryogen und schnell zu entnehmen, sofort und ausreichend in flüssigem Stickstoff schockzufrieren, bei -80 °C zu lagern und auf Trockeneis zu transportieren. Minimieren Sie die Expositionszeit der Gewebeproben gegenüber Raumluft, um die Integrität der RNA zu gewährleisten.
- Können Gewebeproben direkt auf Trockeneis für die Transkriptom-Sequenzierung gelagert werden und wird eine solche Lagerung die Sequenzierungsergebnisse beeinflussen?
- Nachdem die Gewebeproben entnommen wurden, sollten sie in einer RNA-Schutzlösung aufbewahrt und anschließend auf Trockeneis transferiert werden, um den Abbau von RNA zu minimieren, der die Ergebnisse der nachfolgenden Sequenzierung beeinträchtigen kann. (Anmerkung: Gewebeproben sollten zerkleinert und zerschreddert werden, um sicherzustellen, dass die RNA-Schutzlösung die Proben vollständig durchdringt).
- Worauf sollte ich achten, wenn ich klinische Proben wie Tumorproben vorbereite?
- Tumorproben sind hochaktiv und die RNA wird unter Raumtemperaturbedingungen in kurzer Zeit nahezu vollständig abgebaut. Daher wird empfohlen, Tumorproben bei niedriger Temperatur schnell zu entnehmen, sofort und ausreichend in flüssigem Stickstoff schockzufrieren, bei -80 °C zu lagern und auf Trockeneis zu transportieren. Minimieren Sie die Expositionszeit der Gewebeproben in Raumluft, um die Integrität der RNA sicherzustellen (für spezifische Lieferanforderungen beachten Sie bitte unsere Richtlinien zur Lieferung von Transkripten).
- Kann ich Trypsin verwenden, um zellwandhaltige Zellen für RNA-Seq zu verdauen und Proben zu entnehmen?
- 1. Entfernen Sie die adhärent gewachsenen Zellen aus dem Inkubator, beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um den guten Wachstumszustand zu bestimmen, und entsorgen Sie das Medium.
2. Fügen Sie 1×PBS hinzu, das mit demselben Volumen an enzymfreier Wasser wie das Medium vorbereitet wurde, waschen Sie die Zellen 1 Minute lang, entsorgen Sie dann das PBS und wiederholen Sie den Vorgang einmal.
3. Fügen Sie die entsprechende Menge Lysepuffer hinzu und blasen Sie wiederholt, bis die Probe vollständig lysiert ist (z. B. Trizol, für eine 10-15 cm Schale, jeweils 1-2 mL hinzufügen, blasen und mischen. Das Kriterium für eine ausreichende Lyse ist, dass die Flüssigkeit beim Blasen nicht viskos ist und eine gute Fließfähigkeit aufweist. Wenn die Flüssigkeit zu viskos ist, bedeutet dies, dass die Lyse nicht ausreichend ist und mehr Lysepuffer hinzugefügt werden sollte.)
4. Nach dem Transfer in ein gefriergetrocknetes Röhrchen mit Gewinde, das resistent gegen -192 °C ist, zur langfristigen Lagerung im -80 °C Kühlschrank und zum Transport mit Trockeneis.
(Hinweis: Versuchen Sie, keine Trypsinverdauung zu verwenden, da Trypsin eher für die Betriebserfahrung geeignet ist; unsachgemäße Handhabung kann dazu führen, dass die Zellen zerreißen.)
- 1. Entfernen Sie die adhärent gewachsenen Zellen aus dem Inkubator, beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um den guten Wachstumszustand zu bestimmen, und entsorgen Sie das Medium.
- Proben für mRNA, die Probe wurde in Isopropanol gefällt, kann diese direkt versendet werden oder sollte ich die RNA isolieren und dann die Probe senden?
- Nach dem Hinzufügen von Chloroform und Zentrifugieren wird die Probe in eine wässrige Schicht und eine organische Schicht unterteilt. Nach dem Sammeln der wässrigen Schicht kann die RNA durch Isopropanol-Fällung reduziert werden. Da der Kunde den Schritt der Isopropanol-Fällung bereits durchgeführt hat, ist es besser, die RNA zu extrahieren und dann die Probe zu senden, um die Extraktionszeit zu sparen.
- Kann ich eine allgemeine Transkriptomanalyse mit Paraffinsectionsproben durchführen?
- Nein. Paraffin-Schnitte können nicht für das allgemeine Transkriptom verwendet werden. Da das Paraffinprobenmaterial sehr leicht degradiert, kann der mRNA-Fragment in der Probe unvollständig sein.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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