Der Workflow der viralen Metagenomik

Wie funktioniert virale Metagenomik?

Wie allen bekannt ist, infizieren die meisten Viren Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere. Sie verursachen bekannte Infektionskrankheiten (wie die Grippe und Warzen) und sogar einige schwere Krankheiten wie Pocken, Ebola und HIV/AIDS. Da weniger als ein Prozent der mikrobiellen Wirte kultiviert wurden, ist es sehr wichtig, die Gemeinschaftsdynamik von Viren in der Umwelt zu identifizieren und zu messen. Im Gegensatz zu Bakterien und Pilzen gibt es keine evolutionär konservierten Gene, sodass es nicht möglich ist, die virale Vielfalt mit Ansätzen zu überwachen, die analog zu 16S/18S/ITS Amplicon-Sequenzierung. Virale Metagenomik kann Einblicke in die Zusammensetzung und Struktur viraler Gemeinschaften geben.

Der Workflow der viralen Metagenomik umfasst die Probenentnahme, die Reinigung von virusähnlichen Partikeln, die Nukleinsäureextraktion, die Bibliotheksvorbereitung und Metagenomik-SequenzierungEs ist ähnlich wie der Metagenomik-Workflow, aber sie unterscheiden sich in einigen Schritten. Zuerst ist es wichtig, Virionen anzureichern. Zweitens müssen bei RNA-Viren die viralen RNAs in cDNA umgewandelt werden.

Abbildung 1. Workflow-Diagramm für die metagenomische Analyse von Viren (Cholleti et al. 2018).

Reinigungsstufen von viralen Partikeln in der viralen Metagenomik

Es ist kompliziert, repräsentative Gemeinschafts-DNA in Anwesenheit von freier und zellulärer DNA zu isolieren. Der Durchschnitt des viralen Genoms (~50 kb) ist etwa 50 Mal kleiner als der Durchschnitt des mikrobiellen Genoms (~2,5 Mb). Daher wird das Signal der viralen DNA durch zelluläre Kontamination überwältigt, wenn die freie DNA nicht entfernt wird. Hier verwenden wir Abwasser- und klinische Proben als Beispiele, um zu zeigen, wie man Virionen anreichert.

AbwasserprobeZunächst werden 25 mL Glycinpuffer (0,05 M Glycin, 3 % Rinderextrakt, pH 9,6) zu 200 mL Abwasser hinzugefügt und gemischt, um virale Partikel, die an organisches Material gebunden sind, zu lösen. Die Probe wird dann 30 Minuten lang bei 8.000×g zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und durch eine 0,45 μm Polyethersulfon (PES) Membran filtriert, um prokaryotische und eukaryotische Zellen zu entfernen. Viren werden aus dem Überstand durch Inkubation mit PEG 8000 (80 g/L) und NaCl (17,5 g/L) während des Schüttelns (100 U/min) über Nacht bei 4˚C ausgefällt, gefolgt von einer Zentrifugation für 90 Minuten bei 13.000×g. Das resultierende Pellet, das die Viren enthält, wird in 1 mL Phosphatpufferlösung (PBS) eluiert und bei -80˚C gelagert, bevor es weiterverarbeitet wird.

Klinische ProbeVor der Reinigung von Viruspartikeln ist es notwendig, ein Gewebehomogenat vorzubereiten. Für die Homogenisierung wird ein kleiner Würfel Gewebe (ca. 0,5-1 cm³) in ein autoklaviertes Schraubrohr gegeben, das 1 ml PBS-Puffer und 20-30 sterile Keramikperlen enthält. Das Gewebe wird durch viermaliges Schütteln mit maximaler Geschwindigkeit in Intervallen von 15 Sekunden mit dem FastPrep-24-Gerät zerkleinert. Die Dauer dieses Verfahrens betrug etwa 0,5 Stunden. Kohl et al. (2015) beschrieben weitere Informationen zur Reinigung von Viren in klinischen Proben (Abbildung 2).

Abbildung 2. Schematische Beschreibung des klinisch basierten universellen Virusanreicherungsprotokolls für die virale Metagenomik (Kohl et al. 2015).

Nach der Reinigung der viralen Partikel werden alle viralen Konzentrate 15 Minuten lang bei 37 °C mit DNase I und RNase behandelt, um extrazelluläre Nukleinsäuren zu entfernen, anschließend werden die Enzyme bei 70 °C für 5 Minuten inaktiviert.

Extraktion von viraler Nukleinsäure in der viralen Metagenomik

Im traditionellen Verfahren, sobald die Virionen isoliert sind, die virales Metagenom und kloniert. Das Klonen repräsentativer viraler Metagenome ist nach wie vor eine Herausforderung, aufgrund niedriger Nukleinsäurekonzentrationen (~10-17 g DNA pro Virion), modifizierter DNA und der Anwesenheit von letalen Virusgenen wie Lysozymen und Holinen. Um dieses Problem zu lösen, entwickelten Edwards et al. (2005) die Lösung. Zunächst ist es notwendig, genügend Virionen für das Klonen zu gewinnen. Als Nächstes ermöglicht die Linker-amplifizierte Shotgun-Bibliothek (LASL)-Technik das Klonen kleiner DNA-Mengen und wandelt modifizierte DNA über einen PCR-Amplifikationsschritt in unmodifizierte DNA um. Ein Scherprozess stört dann letale Virusgene, indem er die DNA in kleine Fragmente (~2 kb) zerlegt. Es ist somit möglich, repräsentative Metagenomik Bibliotheken.

Heutzutage gibt es viele ausgezeichnete Kits zur Vorbereitung von viralen Nukleinsäuren, wie QIA (Qiagen), NUC (Macherey-Nagel), MIN (BioMerieux) und POW (MO BIIO). Für RNA-Viren muss die RNA in cDNA umgewandelt werden. Alternativ kann das RNA-virale Genom mit TRIzol-LS® Reagenz gereinigt werden, und das DNA-virale Genom kann durch Phenolextraktion aus gereinigten Viruspartikeln isoliert werden. Die Konzentration der gereinigten viralen DNA/RNA sollte mit RiboGreen® oder PicoGreen® Technologien quantifiziert werden. Wenn die Menge an Nukleinsäure für weitere Analysen nicht ausreichend ist, kann die Amplifikation der DNA/cDNA durch die Verwendung eines Kits zur Amplifikation des gesamten Genoms/transkriptoms erreicht werden.

Metagenomische Sequenzierung und bioinformatische Analyse in der viralen Metagenomik

NGS Die Bibliotheksvorbereitung erfolgt mit geeigneten Kits, die von der gewählten Sequenzierungsplattform abhängen. Die gängigen Plattformen für virale Metagenomik-Sequenzierung einschließlich Illumina MiSeq und HiSeq, PacBio RS II usw. Die Grundlagen Bioinformatik Pipeline für virale Metagenomik einschließlich der Qualitätsprüfung (Identifizierung und Entfernung von Sequenzduplikaten und schlecht qualifizierten Basen), der Zuordnung zum Wirtsgenom (unter Verwendung mehrerer Werkzeuge zur Ausrichtung kurzer Reads wie SOAP2, BWA und Bowtie2) sowie der taxonomischen Klassifizierung von viralen Sequenzen.

Abbildung 3. Die grundlegende informatische Analyse der viralen Metagenomik (Cholleti et al. 2018).

Referenzen:

1. Cholleti H, Berg M, Hayer J, et al. Vektorübertragene Viren und deren Nachweis durch virale Metagenomik. Infektionsökologie & Epidemiologie, 2018, 8(1): 1553465.
2. Hjelmsø M H, Hellmér M, Fernandez-Cassi X, et al. Bewertung von Methoden zur Konzentration und Extraktion von Viren aus Abwasser im Kontext der metagenomischen Sequenzierung. PLoS One, 2017, 12(1): e0170199.
3. Kohl C, Brinkmann A, Dabrowski P W, et al. Protokoll zur metagenomischen Virusdetektion in klinischen Proben. Neu auftretende Infektionskrankheiten, 2015, 21(1): 48.
4. Parras-Moltó M, López-Bueno A. Methoden zur Anreicherung und Sequenzierung oraler viraler Assemblagen: Speichel, orale Schleimhaut und Zahnplaque-Virome // Das menschliche Virom. Humana Press, New York, NY, 2018: 143-161.