Übersicht über die Metatranskriptom-Sequenzierung: Prinzipien, Arbeitsablauf und Anwendungen

Was ist metatranskriptomische Sequenzierung?

Metatranskriptomische Sequenzierung bietet direkten Zugang zu kultivierbaren und nicht kultivierbaren mikrobiellen Transkriptominformationen durch großangelegte, hochdurchsatzfähige Sequenzierung von Transkripten aus allen mikrobiellen Gemeinschaften in spezifischen Umweltproben. Die Metatranskriptom-Sequenzierung bietet die Möglichkeit, mRNAs zufällig als Einheit zu sequenzieren, um die Regulierung komplexer Prozesse in mikrobiellen Gemeinschaften zu verstehen. Die Untersuchung des Metatranskriptoms durch Next-Generation-Sequencing-Techniken ermöglicht es uns, Genexpressionsprofile aus ganzen mikroskopischen Populationen zu erhalten, was neue Einblicke in schlecht bekannte biologische Systeme bietet und technische Einschränkungen im Zusammenhang mit der Isolation einzelner Bakterien überwindet.

Herausforderungen der Metatranskriptom-Sequenzierung

Obwohl die aktuellen Metatranskriptomik-Techniken vielversprechend sind, gibt es noch mehrere Hindernisse, die ihre großflächige Anwendung einschränken. Erstens stammt ein Großteil der gewonnenen RNA von ribosomaler RNA (rRNA), und ihre dominierende Häufigkeit kann die Abdeckung von mRNA, die der Hauptfokus der transkriptomischen Studien ist, erheblich reduzieren. Um dies zu überwinden, wurden einige Anstrengungen unternommen, um rRNA effektiv zu entfernen. Zweitens ist mRNA notorisch instabil, was die Integrität der Probe vor der Sequenzierung beeinträchtigen kann. Drittens kann es herausfordernd sein, zwischen Wirts- und mikrobieller RNA zu unterscheiden, obwohl kommerzielle Anreicherungskits verfügbar sind. Dies kann auch durchgeführt werden. in silico Wenn ein Referenzgenom für den Wirt verfügbar ist, wie in der Arbeit von Perez-Losada. u. a.. die die Auswirkungen von Wirt-Pathogen-Interaktionen auf das menschliche Atemwegs-Mikrobiom betrachteten. Schließlich sind Transkriptom-Referenzdatenbanken durch ihre Abdeckung eingeschränkt.

Workflow der Metatranskriptom-Sequenzierung

Der allgemeine Arbeitsablauf für metatranskriptomische Sequenzierung ist in Abbildung 1 dargestellt. Einfach gesagt, besteht der erste Schritt darin, die gesamte RNA aus der Probe zu extrahieren und sie dann zu detektieren. Die qualifizierte RNA wird einer Fragmentierung, dem Aufbau einer Datenbank und entsprechenden Qualitätsprüfungen unterzogen. Die qualifizierte Bibliothek wird sequenziert (hauptsächlich unter Verwendung der Illumina-Sequenzierungsplattform). Die durch die Sequenzierung gewonnenen Rohdaten werden für bioinformatische Analysen verwendet.

Abbildung 1. Ein typischer Arbeitsablauf der Metatranskriptom-Sequenzierung (Peimbert M, u. a.. 2016)

Der Prozess der Bibliotheksvorbereitung für die Metatranskriptomik ist in Abbildung 2 dargestellt. Die beiden Hauptstrategien zur Anreicherung von mRNA werden veranschaulicht, entweder durch die Trennung von rRNA mittels Hybridisierung mit 16S- und 23S-rRNA-Sonden oder durch die Depletion von rRNA mittels einer 5-Exonuklease. Anschließend wird der erste Strang von cDNA mithilfe von reverser Transkriptase unter Verwendung von zufälligen Hexameren synthetisiert. Der zweite Strang von cDNA wird durch eine DNA-Polymerase synthetisiert. Schließlich werden Sequenzierungsadapter an die cDNA-Stränge angefügt, was entweder durch PCR oder durch Ligation erfolgen kann.

Abbildung 2. Der Prozess der Vorbereitung der Metatranskriptom-Sequenzierungsbibliothek (Peimbert M, u. a.. 2016)

Der gesamte Prozess der metatranskriptomischen Sequenzierungsbioinformatik ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Hauptschritte sind: Filtern der Lesungen, Auswählen der Bibliothek zwischen dem Ausrichten der Referenzsequenz und der Durchführung. von neuem Zusammenstellung, Annotation, statistische Analyse und Hochladen der ursprünglichen, zusammengestellten und annotierten Datensätze.

Abbildung 3. Der bioinformatische Gesamtprozess der Metatranskriptom-Sequenzierung (Peimbert M, u. a.. 2016)

Die Anwendungen der Metatranskriptomik

• Menschliche Gesundheit

Symbiotische Bakterien (normale Flora) spielen eine Schlüsselrolle beim Schutz vor Krankheitserregern, können jedoch unter bestimmten Bedingungen die schützenden Abwehrreaktionen des Wirts überwinden und pathologische Effekte auslösen. Die Analyse mikrobieller Populationen kann als Indikator für den Gesundheitszustand eines Individuums und als leistungsstarkes Werkzeug zur Prävention, Diagnose und Behandlung spezifischer Krankheiten verwendet werden.

• Bewertung der Mikrobiom-Immune-Interaktionen

Die Auswirkungen der Mikrobiota auf das mukosale Immunsystem gelten als entscheidend für die Beeinflussung der Wirt-Physiologie. Eine Studie an Toll-like Rezeptor 5 (TLR5) Knockout (KO) Mäusen ist ein interessantes Beispiel für die Verwendung von Metatranskriptomik zur Ergänzung. metagenomische Charakterisierung und 16S rRNA-Genprofilierung dieser mikrobiellen Immuninteraktion. Die Metatranskriptomik-Analyse zeigte, dass die Expression von genverwandten Flagellenmotoren bei TLR5KO-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen hochreguliert war. In diesem Modell führt die Erkennung von Flagellin durch TLR 5 zur Produktion von Anti-Flagellin-Antikörpern, was zu einer Herunterregulierung verschiedener bakterieller Flagellenmotor-Gene führt und somit die Mikrobiota hemmt. Die Deletion von TLR 5 führt zu einer verringerten Produktion von Anti-Flagellin-Antikörpern, was zu einer Hochregulierung bakterieller Flagellenmotor-Gene führt und somit die Fähigkeit der Bakterien im gastrointestinalen Umfeld erhöht, die mukosale Barriere zu stören.

• Studium von kleinen nicht-kodierenden RNAs im Mikrobiom

Das bakterielle Transkriptom umfasst kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs), die typischerweise zwischen 50 und 500 bp groß sind und an der Genregulation beteiligt sind. Sie regulieren die Translation oder Stabilität des Transkripts, indem sie mit der 5'-unübersetzten Region (UTR) der Ziel-mRNA-Sequenz interagieren. Sie sind wichtig für ihre Fähigkeit, bedeutende Prozesse in Bakterien zu regulieren, wie Eisenmetabolismus, Virulenz und Quorum-Sensing, und sich schnell an sich ändernde Umgebungen anzupassen. Das Aufkommen von Next-Generation-Sequenzierungsmethoden hat ihre Identifizierung in verschiedenen Bakterien beschleunigt, wie zum Beispiel Salmonellen und Bacillus subtilisMethoden der Next-Generation-Sequenzierung bieten auch die Möglichkeit, bakterielle sRNAs auf Gemeinschaftsebene zu untersuchen. Zum Beispiel deutet die Metatranskriptomik-Analyse von Bakterien aus verschiedenen Tiefen des Ozeans darauf hin, dass sRNAs eine potenzielle Rolle bei der Nischenanpassung spielen. Die Metatranskriptomik der menschlichen Aktivität im Darmmikrobiom identifizierte eine Reihe von sRNAs, obwohl ihre Rolle im Darmmikrobiom noch nicht aufgeklärt ist.

• Arzneimittelentdeckung

Hunderte von heute verwendeten Medikamenten stammen aus bakteriellen Verbindungen. Die Untersuchung von Metagenomen oder Metatranskriptomen in mikrobiellen Gemeinschaften bietet neue Möglichkeiten, innovative Quellen für die Arzneimittelentdeckung zu erkunden, die heute aufgrund technischer Einschränkungen bei der Isolierung dieser nicht kultivierbaren Mikroorganismen unzugänglich sind.

• Landwirtschaft

Mikrobielle Gemeinschaften, die auf und um Pflanzen leben, spielen eine entscheidende Rolle bei den Nährstoffen, die für das Pflanzenwachstum benötigt werden. Darüber hinaus sorgt das Vorhandensein spezifischer Mikrogemeinschaften dafür, dass Pflanzen gesund und produktiv sind. Metagenomik und Metatranskriptomik bieten die Möglichkeit, zu erforschen, wie mikrobielle Bodenpopulationen gesündere und ertragreichere Pflanzen produzieren.

• Ökologie

Mikroorganismen sind in der Lage, eine Vielzahl von natürlichen und synthetischen schädlichen Substanzen zu entfernen und sie in andere harmlose Verbindungen im Menschen und in der Umwelt umzuwandeln. Ich weiß nicht, wie diese mikrobiellen Gemeinschaften schädliche Chemikalien abbauen, aber sie bieten neue Lösungen zur Reparatur und Überwachung von Umweltverschmutzung oder zur Verbesserung von Methoden zur Trinkwasseraufbereitung.

• Lebensmittelindustrie

Metagenomik- und Metatranskriptomik-Methoden können verwendet werden, um die Lebensmittelqualität, -funktion und -sicherheit zu verbessern und Informationen über die metabolischen Aktivitäten mikrobieller Gemeinschaften bereitzustellen.

Bei CD Genomics bieten wir Ihnen hochwertige Sequenzierung und integrierte Bioinformatik Analyse für Ihre Metatranskriptomik Projekt. Wenn Sie zusätzliche Anforderungen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Referenzen:

1. Peimbert M, Alcaraz L D. Ein Mitfahrer-Handbuch für Metatranskriptom-Sequenzierung [M]// Feldrichtlinien für genetische Versuchsdesigns in der Hochdurchsatz-Sequenzierung. Springer International Publishing, 2016.
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