T-Zell-Rezeptor-Sequenzierung mit RNA-Seq-Protokoll

RNA-Isolation und Qualitätsbewertung

1. Stellen Sie eine korrekte Einrichtung der Chip-Priming-Station sicher.
2. Die folgenden Kit-Komponenten müssen vor der erstmaligen Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet werden:
(a) RNA-Leiter-Aliquote, stabil bei -70 °C über längere Zeiträume.
(b) Agilent RNA 6000 Nano-Gelmatrix-Aliquots (65 μl) können bei 4 °C für 1 Monat gelagert werden (vor Licht während der Verwendung schützen).
3. Um die Gel-Färbematrix vorzubereiten, lassen Sie ein Aliquot der Agilent RNA 6000 Nano-Gelmatrix (65 μl) und das RNA 6000 Nano-Färbekonzentrat 30 Minuten auf Raumtemperatur kommen.
4. Vortexieren Sie die Farbstoffkonzentrate für 10 Sekunden und zentrifugieren Sie sie.
Pipettiere 1 μl Farbkonszentrat zu 65 μl Gelmatrix (eine Aliquot) in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
6. Vortexieren Sie gründlich und überprüfen Sie die ordnungsgemäße Mischung von Gel und Farbstoff.
7. Bei Raumtemperatur 10 Minuten bei 13.000 ×g zentrifugieren, vor Licht schützen und innerhalb von 1 Tag verwenden. Bei Nichtverwendung sofort bei 4 °C lagern.
8. Um die Gel-Farbstoffmatrix zu laden, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Einrichtung der Chip-Priming-Station und legen Sie einen unbenutzten RNA 6000 Nano-Chip auf die Chip-Priming-Station.
Pipettiere 9,0 μl der Gel-Farben-Mischung in den Boden des Wells "G" mit schwarzem Hintergrund.
Positionieren Sie den Kolben der Spritze im Chip-Primierungsstation auf 1 ml; schließen Sie dann die Chip-Primierungsstation und pressurisieren Sie schnell, indem Sie den Kolben nach unten drücken. Halten Sie dies genau 30 Sekunden lang.
11. Lassen Sie den Kolben los und ziehen Sie vorsichtig bis zur 1-ml-Markierung zurück.
12. Öffnen Sie die Chip-Priming-Station und pipettieren Sie 9,0 μl Gel-Farben-Matrix in den Boden der beiden als "G" gekennzeichneten Wells ohne Hintergrund.
13. Pipettieren Sie 5 μl RNA-Marker in alle Probenvertiefungen und die Vertiefung, die mit dem Ladder-Symbol gekennzeichnet ist.
14. Fügen Sie 1 μl Ladder in das mit dem Ladder-Symbol gekennzeichnete Loch hinzu.
15. Fügen Sie 1 μl der interessierenden RNA zu allen Probenbrunnen hinzu. Wenn weniger als 12 Proben zu messen sind, geben Sie 1 μl RNA-Marker in die nicht verwendeten Brunnen.
16. Vortexieren Sie den Chip horizontal im IKA-Vortex (1 Min, 2400 U/min) und setzen Sie ihn innerhalb von 5 Minuten in die Bioanalyzer 2100-Station ein, um die Analyse mit der 2100 Expert Software durchzuführen.

Bibliotheksvorbereitung

Reinigung und Fragmentierung von mRNA

Bringen Sie 0,1–1,0 μg Gesamt-RNA auf ein Volumen von 50 μl mit nukleasefreiem ultrapurem Wasser und übertragen Sie es in die einzelnen Vertiefungen der RNA-Perlenplatte.
2. Vortexieren Sie die RNA-Reinigungsperlen und übertragen Sie 50 μl in jede Vertiefung.
3. Versiegeln Sie die Platte mit Microseal "B" und schütteln Sie die Platte (1 Min., 1000 U/min).
4. Erhitzen Sie die Platte im Mikrowellenheizsystem (5 Min., 65 °C, Deckel geschlossen) und kühlen Sie sie auf Eis (1 Min.).
5. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur (5 Minuten). In der Zwischenzeit das Mikrowärmesystem auf 80 °C bringen.
6. Für das magnetische Absenken entfernen Sie das Siegel und legen die Platte auf den magnetischen Ständer. Überprüfen Sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist.
7. Entfernen Sie die Überstände aus allen Vertiefungen. Nehmen Sie dann die Platte vom Ständer.
Pipettiere 200 μl Bead Washing Buffer in alle Wells; verschließe die Platte und mische durch Schütteln (1 Min, 1000 U/min).
9. Wiederholen Sie die Schritte 6 und 7.
Pipettieren Sie 50 μl Elutionspuffer in alle Wells; verschließen Sie die Platte und mischen Sie durch Schütteln (1 Min., 1000 U/min).
11. Erhitzen Sie die Platte im Mikrowärmesystem (2 Min., 80 °C, Deckel geschlossen) und kühlen Sie sie auf Eis ab (1 Min.).
12. Stellen Sie die Platte auf die Werkbank und entfernen Sie das Siegel.
13. Um sich auf die RNA-Fragmente vorzubereiten, pipettieren Sie 50 μl Bead Binding Buffer in alle Vertiefungen; verschließen Sie die Platte und mischen Sie durch Schütteln (1 Min., 1000 U/min).
14. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur (5 Minuten).
15. Wiederholen Sie die Schritte 6–9 (magnetisches Abziehen, Bead-Waschen, ein weiteres magnetisches Abziehen).
16. Pipettiere 19,5 μl Fragment, Prime, Finish Mix in alle Wells, verschließe die Platte und mische durch Schütteln (1 Min, 1000 U/min).
17. Entfernen Sie das Siegel und übertragen Sie die Proben gut für gut auf die RNA-Fragmente-Platte.
18. Versiegeln Sie die Platte und führen Sie das folgende Programm auf dem Thermocycler mit vorgeheiztem Deckel aus:
(a) 94 °C für 8 Minuten
(b) Bei 4 °C lagern.
19. Schnell herunterfahren.

Erste Strand cDNA-Synthese

Reinige RNA-Fragmente werden mit Hilfe von zufälligen Hexamer-Primern in den ersten Strang cDNA umgeschrieben.
1. Für das magnetische Absenken, die Platte auf den Magnetständer legen. Visuell inspizieren, bis die Flüssigkeit klar ist.
2. Entfernen Sie das Siegel und übertragen Sie 17 μl Überstand gut für gut auf die cDNA-Platte.
3. Zentrifugieren Sie das First Strand Synthesis Act D Mix (5 s, 600 ×g).
4. Mischen Sie SuperScript II Reverse-Transkriptase und den First Strand Synthesis Act D Mix im Verhältnis 1:10 (1 μl SuperScript II Reverse-Transkriptase plus 9 μl First Strand Synthesis Act D Mix, kann über längere Zeiträume bei -20 °C gelagert werden).
Pipettiere 8 μl dieser Mischung in jede Vertiefung der cDNA-Platte und mische durch Schütteln (20 s, 1600 U/min).
6. Zentrifugation (1 Min, 280 ×g).
7. Führen Sie das folgende Programm im Thermocycler mit dem auf 100 °C vorgeheizten Deckel aus:
(a) 25 °C für 10 Minuten.
(b) 42 °C für 15 Minuten.
(c) 70 °C für 15 Minuten.
(d) Bei 4 °C lagern.

Synthese von cDNA des zweiten Strangs

Fügen Sie 5 μl Resuspendierungs-Puffer zu jedem Brunnen hinzu.
2. Zentrifugieren Sie das Second Strand Marking Mix (5 s, 600 ×g) und pipettieren Sie 20 μl in jede Vertiefung. Mischen Sie durch Schütteln (20 s, 1600 U/min).
3. Platten zentrifugieren (1 Min., 280 ×g).
4. Legen Sie die Platte auf den Thermocycler mit einem auf 30 °C vorgeheizten Deckel und lassen Sie sie 60 Minuten bei 16 °C laufen. Lassen Sie sie anschließend auf Raumtemperatur kommen.
5. Pipettieren Sie 90 μl AMPure XP-Perlen in eine neue cDNA-Reinigungsplatte und übertragen Sie den Inhalt der cDNA-Platte gut für gut in die cDNA-Reinigungsplatte. Mischen Sie durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
6. Bei Raumtemperatur inkubieren (15 Minuten) und dann zentrifugieren (1 Minute, 280 ×g).
7. Stellen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer. Überprüfen Sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist. Entfernen Sie 135 μl Überstand aus jedem Brunnen.
8. Waschen Sie die Perlen mit der auf dem Magnetständer gehaltenen Platte, indem Sie 200 μl 80% Ethanol zu allen Wells hinzufügen. Nach 30 Sekunden entfernen Sie das gesamte Überstand aus jedem Well.
Wiederholen Sie Schritt 8 und entfernen Sie sorgfältig den verbleibenden Ethanol (mit einer kleinen Pipette). Lassen Sie die Proben 15 Minuten auf dem Magnetständer an der Luft trocknen.
10. Entfernen Sie die Platte vom Ständer und pipettieren Sie 17,5 μl Resuspendierungspuffer in alle Wells. Mischen Sie durch Schütteln (2 min, 1800 U/min). Lassen Sie die Platte 2 Minuten bei Raumtemperatur stehen.
11. Zentrifugieren (1 Min, 280 ×g).
12. Stellen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer. Inspizieren Sie sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist. Übertragen Sie 15 μl Überstand auf die neue Platte (Adapter-Ligationsplatte). Dies ist der erste sichere Stoppunkt, an dem die versiegelte Platte bei -20 °C für 1 Woche gelagert werden kann.

3' End-Adenylierung und Adapterligierung

Fügen Sie 2,5 μl Resuspensionspuffer zu allen Vertiefungen der Adapter-Ligationsplatte hinzu und zentrifugieren Sie (5 s, 600 ×g).
Pipettiere 12,5 μl A-Tailing-Mix in jede Vertiefung und mische durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
3. Abdeckplatte mit Microseal "B" versehen und zentrifugieren (1 Min., 280 ×g).
4. Inkubieren im Mikrowärmesystem bei 37 °C (30 Minuten), dann in das Mikrowärmesystem bei 70 °C überführen (5 Minuten, Deckel geschlossen) und auf Eis abkühlen (1 Minute).
5. Zentrifugieren Sie die TruSeq RNA CD Indexplatte (1 Min, 280 ×g).
6. Übertragen Sie in dieser Reihenfolge auf alle Wells der Adapter-Ligationsplatten:
(a) 2,5 μl Resuspendierungs-Puffer
(b) 2,5 μl Ligation-Mix
(c) 2,5 μl RNA-Adapter aus der Index-Adapterplatte (in jeden entsprechenden Brunnen). Und mischen durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
7. Zentrifugieren Sie die Platte (1 Min, 280 ×g) und übertragen Sie sie in das Mikroheizungssystem (10 Min, 30 °C, Deckel geschlossen), und kühlen Sie dann auf Eis ab.
8. Zentrifugieren Sie den Stop Ligation Puffer (5 s, 600 ×g) und fügen Sie 5 μl zu jedem Brunnen hinzu. Mischen Sie durch Schütteln (2 min, 1800 U/min).
9. Platten zentrifugieren (1 Min., 280 ×g).
10. Fügen Sie 42 μl AMPure XP-Perlen zu jedem Well hinzu. Mischen Sie durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
11. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (15 Minuten) und zentrifugieren Sie dann die Platte (1 Minute, 280 ×g).
12. Stellen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer. Inspizieren Sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist (ca. 5 Minuten). Entfernen Sie alle Überstände.
13. Waschen Sie die Perlen mit der auf dem Magnetständer gehaltenen Platte, indem Sie 200 μl 80% Ethanol zu allen Wells hinzufügen. Nach 30 Sekunden entfernen Sie das Ethanol.
14. Wiederholen Sie Schritt 13 und entfernen Sie sorgfältig den verbleibenden Ethanol (mit einer Niedervolumenpipette). Lassen Sie die Proben 15 Minuten auf dem Magnetständer an der Luft trocknen.
15. Entfernen Sie die Platte von dem Ständer und pipettieren Sie 52,5 μl Resuspensionspuffer in jede Vertiefung und mischen Sie durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
16. Bei Raumtemperatur inkubieren (2 Minuten).
17. Zentrifugieren Sie die Platte (1 Min, 280 ×g) und stellen Sie sie auf den Magnetständer. Überprüfen Sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist.
Übertragen Sie 50 μl Überstand gut für gut in eine neue Platte.
19. Wiederholen Sie die Schritte 10–17, verwenden Sie jedoch 50 μl AMPure XP-Perlen in Schritt 10 und 22,5 μl Resuspendierungsbuffer in Schritt 15.
Übertragen Sie 20 μl Überstand gut für gut auf eine neue Platte. Die versiegelte Platte kann bei -20 °C für 1 Woche aufbewahrt werden (dies ist der zweite sichere Stopp).

DNA-Fragmentanreicherung

1. Auf Eis 5 μl PCR-Primer-Cocktail und 25 μl PCR-Master-Mix in jede Vertiefung pipettieren, mischen durch Schütteln (20 s, 1600 U/min) und zentrifugieren (1 min, 280 ×g).
2. Übertragen Sie es in den Thermocycler mit dem vorgeheizten Deckel, der auf 100 °C eingestellt ist, und starten Sie den Lauf.
3. Zentrifugieren Sie die Platte (1 Min, 280 ×g) und pipettieren Sie 47,5 μl AMPure XP-Perlen in jede Vertiefung. Mischen Sie durch Schütteln (2 Min, 1800 U/min).
4. Bei Raumtemperatur inkubieren (15 Minuten) und dann zentrifugieren (1 Minute, 280 ×g).
5. Stellen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer. Inspizieren Sie sie visuell, bis die Flüssigkeit klar ist. Entfernen Sie alles Überstand.
6. Waschen Sie die Perlen, während die Platte auf dem magnetischen Ständer bleibt, indem Sie 200 μl 80% Ethanol zu allen Wells hinzufügen. Nach 30 Sekunden entfernen Sie das Ethanol.
7. Wiederholen Sie Schritt 6 von Unterüberschrift 3.2.5 und entfernen Sie sorgfältig den restlichen Ethanol (unter Verwendung einer Niedervolumenpipette). Lassen Sie die Proben 15 Minuten auf dem Magnetständer an der Luft trocknen.
8. Resuspendieren Sie die Perlen in 32,5 μl Resuspensionspuffer. Mischen Sie durch Schütteln (2 Minuten, 1800 U/min).
9. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (2 Minuten) und zentrifugieren Sie dann (1 Minute, 280 ×g).
10. Stellen Sie die Platte auf den magnetischen Ständer. Visuell inspizieren, bis die Flüssigkeit klar ist, und 30 μl Überstand in eine neue Platte übertragen. Bibliotheken können bei -20 °C für 1 Woche aufbewahrt werden (dies ist der dritte sichere Stoppunkt).

Sequenzierung

Die Sequenzierung der Bibliotheken erfolgt auf einem Illumina-Sequenzierungssystem. Es gibt mehrere Konfigurationen, die eine angestrebte Ausbeute von 30 Millionen Reads pro Probe bieten (z. B. Illumina NextSeq 550, 1000 & 2000 und NovaSeq 6000 Systeme). Je nach ausgewähltem Sequenzierungssystem, Flusszelle und Lese-Länge können zwischen 4 und 132 Proben (maximal: zwei S4-Flusszellen auf NovaSeq 6000 mit 2x100 bp Sequenzierung) in einem Sequenzierungslauf multiplexiert werden.