SNP-Genotypisierung durch Multiplex-PCR gezielte Amplicon-Sequenzierung Protokoll

Multiplex-PCR

1. Bereiten Sie das Primer-Mix vor, indem Sie alle Vorwärts- und Rückwärtsprimer hinzufügen. In der resultierenden Lösung sollte jede Primer eine Endkonzentration von 1 μM haben.
2. Bereiten Sie das Multiplex-Master-Mix vor, indem Sie alle Reagenzien außer der DNA-Vorlage hinzufügen. Bereiten Sie genügend Master-Mix für alle Proben und PCR-Blanks vor.
Verteilen Sie 16 μl des Mastermixes in PCR-Streifen/Platten und schließen Sie alle Deckel.
4. Um Kreuzkontamination zu vermeiden, fügen Sie 4 μl DNA-Vorlage einzeln zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu (öffnen Sie jeweils nur ein Röhrchen oder eine Reihe von Röhrchen).
5. Nach der PCR-Vorbereitung die Röhrchen/Strips/Platte in einen Thermocycler außerhalb des alten DNA-Labors stellen und die Amplifikation durchführen: Anfangsschritt bei 95 °C für 10 Minuten, um die Hot-Start-Polymerase zu aktivieren, gefolgt von 30 Zyklen der Denaturierung für 10 Sekunden bei 94 °C, Primer-Annealing für 30 Sekunden bei der erforderlichen Annealing-Temperatur und Elongation für 30 Sekunden bei 72 °C. Das Protokoll endet mit einem abschließenden Erweiterungsschritt bei 72 °C für 4 Minuten.
6. Nach Abschluss der Amplifikation die Reaktionen 1:10–1:100 mit HPLC-reinem Wasser verdünnen. Dies wird das Template für die Indexierungs-PCR sein.

Indexierung der PCR

1. Bereiten Sie den Mastermix vor, indem Sie alle Reagenzien hinzufügen, außer den verdünnten Multiplex-PCR-Produkten und den barcodierten Indexprimern. Bereiten Sie ausreichend Mastermix für alle Proben und PCR-Blanks vor.
Verteilen Sie 7 μl des Mastermixes in PCR-Streifen/Platten und schließen Sie alle Deckel.
Fügen Sie 2 μl des individuellen Barcode-Primer zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu.
4. Fügen Sie 1 μl des verdünnten PCR-Produkts (aus Schritt 1) einzeln zu jedem Reaktionsröhrchen hinzu.
5. Nach der PCR-Vorbereitung führen Sie die Indexierungs-PCR in einem Thermocycler durch: Anfangsschritt bei 95 °C für 10 Minuten, um die Hot-Start-Polymerase zu aktivieren, gefolgt von 10 Zyklen der Denaturierung für 15 Sekunden bei 95 °C, Primer-Annealing für 30 Sekunden bei 60 °C und Elongation für 60 Sekunden bei 72 °C. Das Protokoll endet mit einem abschließenden Erweiterungsschritt bei 72 °C für 4 Minuten.

Bibliotheksreinigung und Quantifizierung

1. Bereiten Sie den Mastermix vor, indem Sie alle Reagenzien hinzufügen, außer den verdünnten Multiplex-PCR-Produkten und den barcodierten Indexprimern. Bereiten Sie genügend Mastermix für alle Proben und PCR-Blanks vor.
2. Reinigen Sie die Reaktionen auf einer magnetischen 96-Well-Platte mit den Agencourt AMPure XP Reagenzperlen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Eluieren Sie die DNA und lagern Sie sie in 20 μl HPLC-reinem Wasser.
3. Quantifizieren Sie die gereinigten Amplicon-Bibliotheken mit dem Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA-Quantifizierungsassay gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Alle Probenbibliotheken mit einer gleichen Menge DNA zusammenführen.

Sequenzierung

1. Messen Sie die DNA-Konzentration der gepoolten Bibliothek mit einem Qubit-Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers und verdünnen Sie sie auf die erforderliche Konzentration.
2. Sequenzieren Sie gereinigte und gepoolte Amplicon-Bibliotheken auf Illumina-Sequenzierern unter Verwendung von CS1, CS2 und deren komplementären Rückwärtssträngen als Sequenzierungsprimer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Referenz:

1. Wutke S, Ludwig A. Zielgerichtete PCR-Amplifikation und Multiplex-Sequenzierung von alter DNA zur SNP-Analyse[J]. Alte DNA: Methoden und Protokolle, 2019: 141-147.