Richtlinien zur Einreichung von Proben
Kleine RNA-Sequenzierung Q&A
Allgemeine Fragen
- Kann die Sequenzierung von kleinen RNAs durchgeführt werden, wenn es kein Referenzgenom für die Art gibt?
- Die Sequenzierung von kleinen RNAs kann für Arten ohne Referenzgenom durchgeführt werden, jedoch ist es notwendig, zunächst die Transkripte ohne Referenztranskriptom zu splicen und die Transkripte als Referenzsequenzen für die Analyse der kleinen RNA-Sequenzierung zu verwenden.
- Für Arten ohne Referenzgenom, wie kann man Small RNA-Sequenzierung zur Vorhersage von Zielgenen durchführen?
- Wir empfehlen Ihnen, zu tun. Transkriptom-Sequenzierung Um großangelegte Transkripte zu entdecken, wird eine Unigene-Bibliothek der Zielart erstellt. Basierend darauf wird eine kleine RNA-Sequenzierung durchgeführt, um bekannte kleine RNAs und vorhergesagte neue miRNAs durch Annotation zu erhalten. Die Zielgenvorhersage erfolgt durch den Vergleich mit Genen in der Unigene-Bibliothek, und schließlich wird die funktionale Annotation der Zielgene abgeschlossen.
- Wie führt man die Qualitätskontrolle von Small RNA-Sequenzierungsbibliotheken durch?
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Die Bibliothekskonstruktion für die Small RNA-Sequenzierung mit Illumina Hiseq2000 erfolgt wie folgt:
(1) PAGE-Gel-Reinigung von kleinen RNA-Molekülen einer bestimmten Größe.
(2) 5'-Splice-Ligation und Reinigung.
(3) 3'-Splice-Ligation-Reinigung.
(4) RT-PCR Amplifikation.
(5) Reinigung der kleinen RNA-Bibliothek.
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Die Bibliothekskonstruktion für die Small RNA-Sequenzierung mit Illumina Hiseq2000 erfolgt wie folgt:
- Kann ich die Ergebnisse der kleinen RNA-Sequenzierung verwenden, um tRNA zu analysieren?
- Nein, das kannst du nicht. Transfer-RNA (tRNA) ist eine universell exprimierte nicht-kodierende RNA mit einer Länge von 70-90 Nukleotiden (nt). tRNA hat eine stabile tertiäre Struktur und einen hohen Grad an Basismodifikationen, Methylierung, Translokationsreaktionen innerhalb von Nukleosiden und Reduktionsreaktionen (notwendig für die Funktion von tRNA).
- Kann ich totale RNA verwenden, um eine Small RNA-Bibliothek vorzubereiten? Oder muss ich Small RNA als Ausgangsmaterial isolieren oder anreichern?
- Kleine RNA-Bibliotheken können aus totaler RNA hergestellt werden. Es ist nicht notwendig, kleine RNA anzureichern, wenn die Konzentration kleiner RNA höher als 0,5 % ist, und es wird empfohlen, totale RNA mit einem RIN-Wert von mehr als 7 zu verwenden. Sie können Kontaktieren Sie uns Für weitere Informationen über unseren tRNA-Sequenzierungsdienst.
- Kann ich angereichertes kleines RNA verwenden, um eine kleine RNA-Bibliothek vorzubereiten?
- Ja, Sie können angereichertes kleines RNA verwenden, und wenn die Menge an angereichertem kleinen RNA nahe bei 10 ng liegt, verdünnen Sie die Verbindung im empfohlenen Verdünnungsverhältnis von 100 ng Gesamt-RNA, wie in den Anweisungen beschrieben. Wenn die Menge an angereichertem kleinen RNA nahe bei 100 ng liegt, verdünnen Sie die Verbindung im empfohlenen Verdünnungsverhältnis von 1 µg Gesamt-RNA, wie in den Anweisungen beschrieben.
- Wie man experimentelle Validierung nach sRNA-Sequenzierung durchführt?
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Es gibt eine Reihe von Methoden zur nachträglichen experimentellen Validierung von sRNA.
1. qPCR, das die Expression von Mikro-RNA verifiziert.
2. RIP-seq, das RNA mit Methylierungsmodifikation oder RNA, die spezifisch an das Zielprotein bindet, durch RIP-Technologie anreichert. Eine Hochdurchsatz-Sequenzierung der angereicherten RNA wird durchgeführt und mit dem Genom verglichen, um Informationen über die Position von Mikro-RNAs zu erhalten, die spezifisch an das Zielprotein binden, usw.
3. Luciferase-Reporter-System.
4. Konstruktion von Überexpressionsvektoren oder Knockdown von Zielgenen.
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Es gibt eine Reihe von Methoden zur nachträglichen experimentellen Validierung von sRNA.
- Was sind die Merkmale unseres Small RNA-Sequenzierungsdienstes?
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(1) Kleine RNA-Moleküle können direkt auf Nukleotid-Ebene untersucht werden, ohne die Probleme der Kreuzreaktivität und des Hintergrundrauschens, die durch die fluoreszierenden Nachahmungssignale traditioneller Mikroarray-Hybridisierungen verursacht werden, was die Unterscheidung verschiedener kleiner RNA-Moleküle derselben Familie sowie ähnlicher Sequenzen erleichtert.
(2) Ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse von Arten ohne die Notwendigkeit vorheriger Sequenzinformationen sowie Informationen zur Sekundärstruktur.
(3) Hohe Sensitivität und hohe Sequenzierungskapazität bieten Datenumfang und Abdeckung für die Entdeckung und Untersuchung von kleinen RNA-Molekülen und ermöglichen die Erkennung seltener Transkripte mit niedriger Häufigkeit.
(4) Die durch Sequenzierung erzeugten Rohdaten sind mit einer Vielzahl von Analyse-Software kompatibel, die die Annotation von genomischen Informationen kleiner RNAs und die Analyse ihrer Expressionsniveaus ermöglicht, die Annotation bekannter kleiner RNAs mithilfe der kleinen RNA-Datenbank sowie die Möglichkeit, nicht zugeordnete Daten weiter zu analysieren, um neue kleine RNA-Spezies und Isoformen zu entdecken und Informationen für vertiefte Studien zu finden.
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(1) Kleine RNA-Moleküle können direkt auf Nukleotid-Ebene untersucht werden, ohne die Probleme der Kreuzreaktivität und des Hintergrundrauschens, die durch die fluoreszierenden Nachahmungssignale traditioneller Mikroarray-Hybridisierungen verursacht werden, was die Unterscheidung verschiedener kleiner RNA-Moleküle derselben Familie sowie ähnlicher Sequenzen erleichtert.
- Wie man eine Rohsignal-Analyse von sRNA-Sequenzierungen durchführt
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(1) Datenqualitätskontrolle: Die Qualität der Sequenzierungsdaten ist eine wichtige Voraussetzung für die Zuverlässigkeit der Analyseergebnisse. sRNA-Rohdaten müssen Qualitätskontrollprozesse durchlaufen, wie z.B. Junction-Sequenzen, das Entfernen von N-haltigen Basensequenzen, das Entfernen von Basensequenzen niedriger Qualität, Längenscreening usw., um hochwertige Sequenzierungsdaten zu erhalten und die Anzahl der kleinen RNA-Spezies sowie die Längendistibution zu zählen.
(2) Referenzgenom-Ausrichtung: Ausgehend von den sauberen Reads jeder Probe nach der Längenauswahl werden die Reads an das Referenzgenom ausgerichtet und die Ausrichtungsergebnisse werden gezählt.
(3) Analyse bekannter miRNAs: Die Reads werden mit der miRNA-Datenbank verglichen, um bekannte Mikro-RNAs zu identifizieren.
(4) Analyse von nicht-kodierenden RNAs: Vergleichen Sie die Reads mit ncRNA-Sequenzen von Arten oder der Rfam-Datenbank, um rRNA, tRNA, snRNA und snoRNA zu identifizieren.
(5) Neuartige miRNA-Vorhersage: Führen Sie eine neuartige miRNA-Vorhersage mit miREvo durch und analysieren Sie Aspekte wie Basenpräferenz und Sekundärstruktur.
(6) Genexpression und differenzielle Analyse: bekannte miRNAs und neue miRNAs basierend auf den Vergleichsergebnissen quantifizieren und eine differenzielle miRNA-Analyse durchführen, um differentiell exprimierte miRNAs zwischen Proben oder Untergruppen zu erhalten.
(7) miRNA-Zielgenvorhersage: Führen Sie eine differenzielle miRNA-Zielgenvorhersage mit sowohl der miRanda- als auch der RNAhybrid-Software durch.
(8) Funktionelle Anreicherung: Basierend auf den Zielgenen der differentiellen miRNAs zwischen Proben oder Untergruppen erhalten wir signifikant angereicherte funktionelle Informationen durch funktionelle Annotationsdatenbanken wie GO, KEGG usw.
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(1) Datenqualitätskontrolle: Die Qualität der Sequenzierungsdaten ist eine wichtige Voraussetzung für die Zuverlässigkeit der Analyseergebnisse. sRNA-Rohdaten müssen Qualitätskontrollprozesse durchlaufen, wie z.B. Junction-Sequenzen, das Entfernen von N-haltigen Basensequenzen, das Entfernen von Basensequenzen niedriger Qualität, Längenscreening usw., um hochwertige Sequenzierungsdaten zu erhalten und die Anzahl der kleinen RNA-Spezies sowie die Längendistibution zu zählen.
- Wenn es keine Genomsequenz gibt, wie findet man die relevanten miRNAs und ihre Zielgene?
- Der erste Weg besteht darin, auf die vorhandene Literatur zu verweisen, zum Beispiel spielen miR156 und miR172 eine Rolle im Übergang vom vegetativen zum reproduktiven Wachstum. Wenn eine Genomsequenzierung nicht möglich ist, sollten stattdessen eine Transkriptomsequenzierung und eine kleine RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um das Transkriptom als Referenz zu analysieren. Schließlich können die Sequenzen direkt an einige Online-Software wie psRNATarget zur Vorhersage von Zielstellen übermittelt werden.
- Bei der Durchführung von sRNA-Sequenzierung benötige ich neben der Probe folgende relevante Informationen:
- Das Genom der jeweiligen Art sowie die relevanten Exon-, Intron- und Wiederholungsinformationen sind erforderlich. Falls das Genom der Art nicht verfügbar ist, sind Informationen über eng verwandte Arten erforderlich.
- Was ist die Lese-/Taglänge für Small RNA-Sequenzierung mit dem Illumina Hiseq2000? Was ist die empfohlene Abdeckungstiefe?
- Für die Sequenzierung von kleinen RNAs können die Kunden die Länge der kleinen RNAs auswählen, die sie interessiert, nämlich 18-30 nt. Für die Illumina Hiseq2000 empfehlen wir eine Sequenzierlänge von 35 bp, nach der die Sequenzinformationen bearbeitet werden, um die Spleißsequenz zu entfernen und nur die kleine RNA-Sequenz zu belassen. Für Entdeckungs- und Analysestudien zu kleinen RNAs empfehlen wir während der Sequenzierung nicht die DepthofCoverage, da eine Expressionsanalyse der kleinen RNAs durchgeführt werden muss. Im Allgemeinen werden pro Probe mindestens 5 Millionen Reads erfasst, was genügend Informationen bietet, um eine genaue Sequenzierung sicherzustellen.
- Welche Faktoren beeinflussen die Small RNA-Sequenzierung?
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Die Einflussfaktoren der sRNA-Sequenzierung sind hauptsächlich wie folgt:
(1) Die Qualität der vom Kunden bereitgestellten Probe. Im Prozess der Small RNA-Sequenzierung muss sRNA isoliert werden, und die Qualität sowie die Reinheit der isolierten Small RNA beeinflussen direkt die Sequenzierungsergebnisse. Da RNA leicht abgebaut wird, müssen die Schritte der RNA-Extraktion und -Reinigung strikt gemäß den experimentellen Anforderungen durchgeführt werden, um die Qualität der Proben sicherzustellen.
(2) Qualität der Bibliothekskonstruktion: Die Konstruktion der Bibliothek erfordert PAGE-Gel, um kleine RNA zu trennen und zu reinigen, und anschließend die Verbindung für die Reinigung vor der RT-PCR herzustellen. In diesem Prozess ist eine sorgfältige Handhabung erforderlich, um sicherzustellen, dass kleine RNA nicht abgebaut wird, und der Reinigungsprozess sollte gewährleisten, dass die Verbindung sauber entfernt wird. Rückstände der Verbindung können Auswirkungen auf die nachfolgende Sequenzierung haben.
(3) Kontrolle des Ladevolumens der Sequenzierungsbibliothek: Dieser Faktor beeinflusst auch in hohem Maße die Dichte der Clusterbildung. Da das Ladevolumen sehr klein ist, nur 1-8 pg, wird die Fähigkeit, Mikromuster genau zu quantifizieren, ebenfalls zu einem wichtigen Faktor, der den Sequenzierungsdurchsatz beeinflusst.
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Die Einflussfaktoren der sRNA-Sequenzierung sind hauptsächlich wie folgt:
Probenvorbereitung
- Welche Arten von Proben können von unserem sRNA-Sequenzierungsdienst verarbeitet werden?
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Probenarten: Zellen, frisches Gewebe, FFPE-Gewebe, Blut-RNA, Serum-Plasma-RNA oder exosomale RNA-Proben usw.
Spezies: Mensch, Maus und RatteFragen Sie den technischen Support nach Details zu speziellen Arten.).
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Probenarten: Zellen, frisches Gewebe, FFPE-Gewebe, Blut-RNA, Serum-Plasma-RNA oder exosomale RNA-Proben usw.
- Welche Art von Probenanforderungen gibt es für Small RNA-Sequenzierung?
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(1) Anforderungen an die Probenreinheit: Der OD-Wert sollte zwischen 1,8 und 2,2 liegen; das Verhältnis von 28S:18S muss mindestens 1,5 für die Elektrophorese-Detektion betragen.
(2) Probenkonzentration: Die Gesamtrna-Konzentration sollte nicht weniger als 200 ng/μL betragen, bitte verwenden Sie keine Über-Säulen-Methode zur Extraktion von Gesamtrna, die Gesamtprobe sollte nicht weniger als 20 μg betragen (Kleine RNA: Gesamtrna > 0,3 %). Oder stellen Sie kleine RNA-Proben mit einer Konzentration von mehr als 20 ng/μL und einer Gesamtmenge von mehr als 1 μg zur Verfügung.
(3) Kleine RNA-Proben sollten bei -20°C gelagert werden; bitte geben Sie die spezifische Konzentration, das Volumen, die Vorbereitungszeit, den Namen des Lösungsmittels und die Herkunft der Spezies der kleinen RNA-Proben an. Bitte fügen Sie auch QC-Daten einschließlich Elektrophorese-Gel-Diagramm, spektrophotometrische oder Nanodrop-Instrumenterkennungsdaten hinzu. Wenn mehrere Probenvorbereitungen erforderlich sind, geben Sie bitte die für die mehreren Probenvorbereitungen benötigten Proben an.
(4) Probentransport: Proben sollten in 1,5 ml Röhrchen transportiert werden, auf denen der Probenname, die Konzentration und die Vorbereitungszeit angegeben sind, und die mit Parafilm verschlossen sind. Es wird empfohlen, Trockeneis für den Versand zu verwenden und eine schnellere Versandmethode zu wählen, um die Möglichkeit einer Probenzerstörung während des Versands zu verringern.
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(1) Anforderungen an die Probenreinheit: Der OD-Wert sollte zwischen 1,8 und 2,2 liegen; das Verhältnis von 28S:18S muss mindestens 1,5 für die Elektrophorese-Detektion betragen.
- Was sind die besonderen Anforderungen an die Probenentnahme für das Sequenzieren von kleinen RNAs?
- Es wird empfohlen, keine Über-Säulen-Kits von Qiagen und anderen Unternehmen oder LiCl-Präzipitation zu verwenden, um den Verlust kleiner RNA-Fragmente zu vermeiden. Wenn kleine RNA-Proben direkt bereitgestellt werden, können spezielle Kits zur Extraktion kleiner RNA für die Extraktion verwendet werden.
- Warum gibt es in den Ergebnissen degradierte rRNA-Sequenzen?
- Da totale RNA oft leicht degradiert ist und es einen natürlichen Degradationsprozess in Organismen gibt, wird die Daten eine kleine Menge an degradierten mRNA-Fragmenten enthalten. Dieser Prozentsatz ist jedoch in der Regel sehr gering und hängt von der Qualität des gesamten RNA-Probenmaterials ab.
Nur für Forschungszwecke, nicht zur klinischen Diagnose, Behandlung oder individuellen Gesundheitsbewertung bestimmt.
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