Vorbereitung einer kleinen RNA-Bibliothek für das Protokoll der Next-Generation-Sequenzierung

RNA-Isolierung

1. Homogenisieren Sie Gewebeproben: Mahlen Sie 100 mg Gewebe in flüssigem Stickstoff, bis ein feines Pulver entsteht. Mischen Sie 1 mL TRI Reagent®-Lösung mit dem Pulver in einem Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Alternativ homogenisieren Sie kultivierte Zellen oder Körperflüssigkeiten: Homogenisieren und lysieren Sie die Zellen direkt, indem Sie 1 mL TRI Reagent®-Lösung pro 5–10 × 10^6 Zellen oder pro 10 cm² Kulturflächenbereich hinzufügen und pipettieren Sie auf und ab.
3. Inkubieren Sie die Mischung 5 Minuten bei Raumtemperatur, um eine vollständige Dissoziation der Nukleoprotein-Komplexe zu ermöglichen.
Fügen Sie 200 μL Chloroform hinzu und mischen Sie kräftig für 15 Sekunden. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für weitere 5 Minuten.
5. Zentrifugieren Sie die Probe bei 16.000 × g bei 4 °C für 15 Minuten. Die Probe sollte sich in eine klare wässrige Phase oben, eine weiße Interphase in der Mitte und eine rosa organische Phase am Boden des Röhrchens trennen. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und achten Sie darauf, keine der Interphase oder der organischen Phase mitzunehmen. Notieren Sie das Volumen der übertragenen wässrigen Phase.
6. Fügen Sie 1 Volumen Isopropanol zur wässrigen RNA-Extraktion hinzu und mischen Sie gründlich. Dies kann bei Raumtemperatur für 10 Minuten oder bei -80 °C für 30 Minuten inkubiert werden. Die Ko-Präzipitationszeit und -temperatur können je nach Probe variieren und müssen möglicherweise für den betreffenden Organismus oder Gewebetyp optimiert werden.
7. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 × g bei 4 °C für 10 Minuten und entfernen Sie den Überstand. Ein weißes Pellet sollte sich am Boden des Röhrchens gebildet haben – das ist die RNA.
8. Waschen Sie das Pellet mit 1 ml 80% Ethanol. Vortexen Sie, um das Pellet zu lösen, und zentrifugieren Sie bei 7500 × g für 5 Minuten bei 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
9. Entfernen Sie den verbleibenden Ethanol und lassen Sie das RNA-Pellet 5–10 Minuten an der Luft trocknen, indem Sie das Röhrchen offen lassen. Resuspendieren Sie die RNA in dem gewünschten Volumen von nukleasefreiem Wasser und lagern Sie sie bei -80 °C. Wenn es Schwierigkeiten gibt, die RNA in Lösung zu bringen, können das Wasser und die RNA-Probe 5 Minuten lang auf 70 °C erhitzt werden.
10. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem NanoDrop.

sRNA-Reinigung

1. Mischen Sie das RNA-Eluat mit drei Volumina absolutem Ethanol, 0,1 Volumen Natriumacetat (pH 5,0) und 1 μL Glykogen (5 mg/mL); und lagern Sie es über Nacht bei -20 °C oder -80 °C. Zentrifugieren Sie die Proben bei 20.000 × g für 20 Minuten bei 4 °C, waschen Sie das RNA-Pellet zweimal mit 80% Ethanol, lassen Sie die RNA 5 Minuten an der Luft trocknen und resuspendieren Sie sie in einem geeigneten Volumen von nukleasefreiem Wasser. Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem NanoDrop.

Adenylierung des 3' HD Adapters

1. Die Adenylierung des 3' HD-Adapters sollte gemäß den Anweisungen des Herstellers für das 5' DNA-Adenylierungs-Kit durchgeführt werden.
2. Inkubieren Sie die Reaktion bei 65 °C für 1 Stunde.
3. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch 5 Minuten lang bei 85 °C, um die Mth RNA-Ligase zu inaktivieren, und kühlen Sie es dann auf Eis.
4. Reinigen Sie den adenylierten Adapter mit dem Zymo Oligo Clean and Concentrator gemäß den Anweisungen des Herstellers.
5. Bestimmen Sie die Konzentration des adenylisierten Adapters mit dem Nanodrop und passen Sie sie auf eine Endkonzentration von 10 μM an. Das Molekulargewicht des 3' HD-Adapters beträgt 8015 g/mol.
6. Führen Sie den adenylierte und den nicht-adenylierte Adapter auf demselben 15% Urea-Polyacrylamid-Gel aus. Um ein 15 mL Urea-Polyacrylamid-Gel vorzubereiten, bereiten Sie zunächst eine 5 mL Lösung aus 3,5 mL nukleasefreiem Wasser und 1,5 mL 5× TBE in einem 50-mL Falcon vor.
Röhrchen. Wiegen Sie 6,3 g Harnstoff ab und lösen Sie ihn in der Wasser/TBE-Lösung bei 37–42 °C auf. Es wird nicht empfohlen, das Gemisch in der Mikrowelle zu erhitzen, da das Falcon-Röhrchen explodieren kann. Fügen Sie 5,5 mL einer 40%igen Acrylamid/Bis-Lösung (19:1) hinzu, gefolgt von 7,5 μL N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamin (TEMED) und 150 μL einer 10%igen Ammoniumpersulfatlösung (APS). Stellen Sie das Endvolumen auf 15 mL mit nukleasefreiem Wasser ein. Der adenylierte Adapter kann bei -80 °C gelagert werden.

3' HD Adapter Ligierung

1. Tauchen Sie 50% PEG 8000 in einem 37 °C Heizblock auf und lassen Sie es dann bei Raumtemperatur für den Rest des Protokolls stehen.
2. Stellen Sie die Heizblöcke auf 26 °C und 70 °C ein.
Mischen Sie 11,25 μL der RNA-Probe mit 1 μL von 10 μM vor-adenyliertem 3' HD-Adapter.
4. Denaturieren Sie die RNA- und Adaptermischung bei 70 °C für 2 Minuten und kühlen Sie sie dann auf Eis.
5. Fügen Sie das folgende Ligation-Reaktionsgemisch zur denaturierten RNA- und Adaptermischung hinzu.
6. Inkubieren Sie das Reaktionsgemisch bei 26 °C für 2 Stunden.
7. Reinigen Sie die 3'-Ende-Ligationreaktion mit dem Zymo RNA Clean and Concentrator gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll. Eluieren Sie im letzten Schritt der Kit-Reinigung die RNA in 12,1 μL nukleasefreiem Wasser und lagern Sie sie auf Eis.

Entfernung des überschüssigen 3' HD Adapters

Deadenylieren Sie den verbleibenden 3' HD-Adapter mit der Deadenylase von NEB.
2. Inkubieren Sie das obige Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 30 °C.
3. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 4 μL einer 25 mM EDTA-Lösung hinzufügen, und stellen Sie das Röhrchen sofort auf Eis.
4. Fügen Sie 2 μL von 0,5 M Tris–HCl (pH 9,0) und 7 μL von 50 mM MgCl hinzu.₂und 1 μL RecJ Exonuklease in das Röhrchen geben. Gut mischen.
5. Inkubieren Sie die Exonuklease-Reaktion bei 37 °C für 30 Minuten.

5' HD-Adapter-Ligation

1. Denaturiere 1 μL von 20 μM 5' HD-Adapter bei 70 °C für 2 Minuten und kühle es auf Eis.
2. Fügen Sie den denaturierten 5' HD-Adapter zur Exonuklease-Reaktionsmischung hinzu.
3. Fügen Sie die Reagenzien nacheinander in das Röhrchen ein und mischen Sie durch Pipettieren.
4. Inkubieren Sie die 5'-Ligation bei 26 °C für 2 Stunden.
5. Reinigen Sie die 5'-Ligationreaktion mit dem RNA Clean and Concentrator Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers; elutieren Sie im letzten Schritt das Ligationgemisch in 30 μL nukleasefreiem Wasser und stellen Sie die Reaktion auf Eis.

cDNA-Synthese und Amplifikation

1. Richten Sie die folgende cDNA-Synthesereaktion ein und mischen Sie gründlich. Inkubieren Sie bei 37 °C für 20 Minuten.
2. Inaktivieren Sie die Reaktion, indem Sie sie 15 Minuten lang bei 85 °C inkubieren und dann auf Eis abkühlen. Das aus diesem Schritt erzeugte cDNA kann unbegrenzt bei -20 °C oder -80 °C gelagert werden.
3. Stellen Sie das folgende PCR-Reaktionsgemisch zur Amplifikation der cDNA-Bibliothek zusammen.
4. Führen Sie die PCR-Reaktion unter den folgenden Bedingungen durch. Die Endprodukte können bei -20 °C unbegrenzt gelagert werden.

Gel-Elektrophorese und Extraktion von PCR-Produkten

1. Führen Sie die PCR-Produkte auf einem nativen 8% Polyacrylamidgel aus und laden Sie eine 20-bp DNA-Leiter zur Größenbestimmung. Wir verwendeten das Mini-PROTEAN III-System für die Elektrophorese.
2. Führen Sie das Gel bei 120 V für 1,5–2 Stunden in 0,5× TBE aus.
Färben Sie das Gel mit SYBR® Gold und visualisieren Sie es auf einem Scanner oder UV-Box.
4. Schneiden Sie die DNA-Banden bei 145–150 bp mit einem sterilen Rasiermesser aus – dies enthält die cDNA-Bibliothek der sRNAs.
5. Platzieren Sie das Gel in ein "Gelbrecherglas" und zentrifugieren Sie es bei 20.000 × g für 5 Minuten. Wir stellen diese Gläser her, indem wir den Boden eines 0,5-ml Eppendorf-Glases mit einer BD Microlance 3 Nadel (0,8 mm × 16 mm) durchstechen.
6. Eluieren Sie die cDNA-Bibliothek in 1× NEB Restriktionsenzym-Puffer 2, indem Sie die Gel-Suspension über Nacht bei 4 °C schütteln.
7. Fügen Sie die Gel-Suspension in eine Spin-X nicht sterile 45-μm-Säule ein und zentrifugieren Sie bei 650 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um Gelreste zu entfernen. Es ist hilfreich, die Spitze des Pipettiers zuerst abzuschneiden, um die Öffnung zu vergrößern, bevor Sie sie in die Säule laden.
8. Konzentrieren Sie die elutierte cDNA-Bibliothek durch Ethanolpräzipitation über Nacht bei -80 °C unter Verwendung der folgenden Verhältnisse: Für 300 μL Eluat fügen Sie 2 μL GlycoBlue (5 mg/mL), 30 μL 3 NaOAc und 975 μL absoluten Ethanol hinzu. Lassen Sie die Mischung über Nacht bei -20 °C oder -80 °C stehen.
Zentrifugieren Sie 20 Minuten bei 20.000 × g bei 4 °C.
10. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit 80% Ethanol.
Lufttrocknen für 5–10 Minuten und in 12 μL nukleasefreiem Wasser wieder suspendieren.
12. Führen Sie das Produkt auf einem zweiten 8% Polyacrylamidgel aus und wiederholen Sie die Schritte 1–11 dieses Abschnitts, um alle anderen Produkte unerwünschter Größe zu entfernen.
13. Senden Sie die cDNA-Bibliothek zur Sequenzierung. Für sRNA-Bibliotheken sequenzieren wir typischerweise mit einer Standardtiefe von 20 Millionen Reads pro Probe.