Erforschung des Zellzyklus aus der Perspektive des Einzelzell-Transkriptoms

Die Zellteilung ist ein grundlegender biologischer Prozess mit Merkmalen und grundlegenden Mechanismen, die in allen Eukaryoten erhalten sind. Der Prozess, der zwischen dem Beginn des Wachstums einer neuen Zelle, die durch Zellteilung entsteht, und dem Ende der nächsten Zellteilung zur Bildung von Tochterzellen stattfindet, wird normalerweise als Zellzyklus bezeichnet. Der Zellzyklus umfasst vier Phasen: G1, S, G2 und M. Es handelt sich um eine Reihe von Ereignissen, in denen die zelluläre DNA repliziert, wächst und sich teilt.

Unter Geweben können selbst Zellen desselben Typs in unterschiedlichen Zellzyklen sein. Traditionelle Methoden zur Untersuchung des Zellzyklus, wie PI (Propidiumiodid) Färbeexperimente und die Erkennung verwandter Moleküle, haben Nachteile wie komplizierte Experimente, begrenzte verfügbare Marker, größere Schwierigkeiten bei der Auffindung von Zellen im Zwischenzustand und Schwierigkeiten bei der Analyse von Schlüsselkgenen im Prozess. Im Gegensatz dazu bietet die Einzelzelltechnologie eine neue Richtung für die Zellzyklusforschung aufgrund ihrer relativen Einfachheit, der Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Genexpressionsprofilen, der Fähigkeit, seltene Zellen zu erfassen, und der Möglichkeit, Schlüsselkgenen ohne a priori Informationen zu finden.

Die Pseudotime-Analyse in der Zellzyklusforschung

Zellen beginnen sich nach einer Reihe von Kontrollpunkten für Wachstum und Vorbereitung auf die Teilung zu teilen. Diese Schritte werden durch die Aktivität spezifischer Proteine gesteuert, die zeitlich und räumlich durch transkriptionale Regulation, posttranslationalen Modifikationen und Proteinabbau reguliert werden. Studien zum Zellzyklus haben gezeigt, dass Hunderte von Genen und Proteinen durch den Zellzyklus reguliert werden. Ein Vorteil der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ist die Pseudotime-Analyse. Die Pseudotime-Analyse wird verwendet, um den Verlauf zellulärer Veränderungen aus statischen Daten abzuleiten, indem Trajektorien interzellulärer Veränderungen konstruiert werden. In Bezug auf spezifische Klassifikationsanalysen und Komplexität kann die Pseudotime-Analyse in Zelltrajektorienanalyse und Zellgenealogieanalyse unterteilt werden.

Die Analyse von Zelltrajektorien bezieht sich auf die Veränderung von Zellen in eine bestimmte Richtung, wobei die Trajektorie einen einfacheren Start- und Endpunkt hat; die Analyse der Zellgenealogie bezieht sich normalerweise auf Vorläuferzellen mit mehreren Entwicklungstrajektorien und Schicksalen unter spezifischen Bedingungen, und der Veränderungsprozess ähnelt einer komplexen baumartigen Struktur. Darüber hinaus ermöglicht die Clusteranalyse die Rekonstruktion kontinuierlicher Zellzyklusprozesse. Durch die Analyse spezifisch exprimierter Gene können neue Gene mit unbekannten Assoziationen zur Zellteilung und zum Zellzyklus identifiziert werden, zum Beispiel können andere zellzyklusabhängige (CCD) Gene effizient mithilfe von scRNA-seq entdeckt werden, usw.

Trajektorienbasierte differenzielle Expressionsanalyse. (Van den Berge et al., 2020)

Außer bei scRNA-seq werden Zellzyklusstudien normalerweise in synchronisierten Zellpopulationen durchgeführt, die von Genexpression, Zellmorphologie und metabolischen Veränderungen beeinflusst werden, was die Untersuchung von Expressionsänderungen in den Phasen des Zellzyklus einschränkt. Daher wird scRNA-seq neben Studien zur Regulierung von Entwicklungssignalen, molekularen Mechanismen und Resistenzmechanismen häufig in Zellzyklusstudien eingesetzt, z. B. bei klassischen Fragen wie der Entwicklung biologischer Merkmale, Fragen zur regenerativen Kapazität von Geweben nach Verletzungen und der Meiose von Keimzellen.

Die vergleichende Analyse von zellzyklusbezogenen Genen kann konservierte und einzigartige zellzyklus-spezifische strukturelle Domänen aufzeigen und auch wichtige Informationen für die funktionale Analyse des Zellzyklusfortschritts in der Einzelzell-RNA-Analyse und der Annotation von Zellzyklus-Markergenen bereitstellen. Die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung wichtiger Zelllinien kann auch die zellzyklusabhängige transkriptionale Heterogenität offenbaren, die in zellulären Taxa vorhanden ist. Ein kontinuierlicher Zellzyklusfortschritt wurde durch eine mimetische Zeitanalyserekonstruktion wiederhergestellt, die Differenzierungstrajektorien einschließlich des Eintritts und Austritts aus dem Zellzyklus aufzeigte; zudem wurde eine Reihe von putativen, zellzyklus-spezifisch exprimierten Genen identifiziert.

Eine vergleichende Analyse mit zellzyklusbezogenen Genen aus anderen Studien wurde durchgeführt, um konservierte und spezifische strukturelle Domänen und Gene in verschiedenen Stadien zu ermitteln. Die Analyse des Zellzyklus in Verbindung mit der mimetischen Analyse kann angewendet werden, um die Stammzell-Eigenschaften von Zellen anzuzeigen, die Wirkung von Medikamenten zur Blockierung des Zellzyklus zu identifizieren usw. und hat potenzielle Anwendungen in Differenzierungs- und Entwicklungsprozessen, der Reparatur von Krankheitsschäden und der Tumorimmunogenese.

Die Annotation des Zellzyklus

Jede Phase des Zellzyklus hat signifikante Marker-Gene, und durch die Analyse der Expression von Genen, die mit dem Zellzyklus in Verbindung stehen, kann der Zyklus, in dem sich eine Zelle befindet, annotiert werden. Basierend auf den Zyklus-Signaturgenen und der Einzelzell-Expressionsmatrix kann der Zykluszustand, in dem sich eine einzelne Zelle befindet, bewertet werden, um zu bestimmen, ob sich die Zelle in einem proliferativen Zustand befindet.

Zellzyklusfortschritt. (Wang 2021)

In Meiose-Studien ist es schwierig, dass das gewöhnliche Transkriptom die Mechanismen der Genexpressionsregulation während der Meiose genau widerspiegelt, da die Meiose der Keimzellen in den Geweben nicht gleichzeitig erfolgt. Der Einzelzellansatz kann das Problem der Heterogenität gut angehen. In der Einzelzell-Transkriptomanalyse kann der Zellzyklus, in dem sich jede Zelle befindet, aus den Daten der Gencluster in spezifischen Zellzyklusphasen abgeleitet werden. Zum Beispiel exprimieren meiotische Zellen mehrere Histonuntereinheiten mit Mikrotubuli-bindenden Proteinen, und die kombinierte Expression von Zellzyklusproteinen und zellzyklusabhängigen Kinasen tritt in den ursprünglichen Zellen nicht auf.

Dieses Phänomen kann verwendet werden, um zwischen der ersten Phase der Prophase der Meiose und der mitotischen Zellphase zu unterscheiden. Die Identifizierung primitiver regulatorischer Gene der Zellentwicklung durch die Berechnung der Korrelation jedes Gens mit dem Zellzyklus, der dem vorgeschlagenen Entwicklungszeitpunkt am nächsten kommt, ist eine Analyse, die primitive Gene der Zell-Differenzierung von regulatorischen Genen des Zellzyklus unterscheiden kann, was mit Daten aus gesamten Geweben nicht möglich wäre. Es ist zu erkennen, dass durch das Studium der Expressionsmuster spezifischer Gene in einzelnen Zellen Zellen in verschiedenen Phasen des Zyklus effektiv identifiziert und kategorisiert werden können.

Zellen im gleichen Stadium gruppieren sich miteinander, während Zellen in unterschiedlichen Stadien deutlich getrennt sind und einen Zyklus in der Verteilung der PCA bilden, was es ermöglicht, den dynamischen Prozess des Zellzyklus aus statischen Daten abzuleiten, die Schwierigkeit der Zellheterogenität und Datenhomogenisierung zu lösen und präzise Antworten auf wissenschaftliche Fragen auf zellulärer Ebene zu ermöglichen.

Auswirkungen des Zellzyklus auf die Datenanalyse

Bei der Durchführung von Zellzyklusstudien können Gewebe zwei sehr unterschiedliche Zellpopulationen enthalten, z. B. Zellen, die sich proliferieren, und Zellen, die quieszent oder seneszent sind. Methoden, die molekulare Assays verwenden, können nur einen intermediären Zustand berichten, der dann nicht wirklich einen der Zelltypen widerspiegelt.

Bei der Fokussierung auf die Heterogenität von Zelltypen kann der Zellzyklus als der wichtigste systematische Bias betrachtet werden. In Einzelzell-Transkriptomdaten stammen Zellen desselben Typs oft aus verschiedenen Zellzyklusphasen, was die nachgelagerte Clusteranalyse beeinflussen kann und sich darin äußert, dass Zellen desselben Typs in unterschiedliche Zellpopulationen unterteilt werden. Darüber hinaus können bei der Durchführung von Zellclustering unterschiedliche Zelltypen in einem proliferativen Zustand sein und aufgrund der hohen Expression von zellzyklusbezogenen Genen in Gruppen geclustert werden, was tatsächlich eine Mischung aus mehreren Zellen darstellt. Daher sollte die Notwendigkeit, den Einfluss des Zellzyklus auf das Clustering zu entfernen, während der Analyse in Anbetracht des gesamten Experiments berücksichtigt werden.

Die Analyse des Zellzyklus ermöglicht es uns, den Zustand der Zellen zu verstehen. Wenn die Clusterergebnisse stark vom Zellzyklus beeinflusst werden, muss der Einfluss des Zellzyklus basierend auf der wissenschaftlichen Fragestellung, die untersucht wird, entfernt werden, um den biologisch signifikanten Anteil zu erhalten. Ist der Anteil sehr klein, kann es auch sinnvoll sein, ihn nicht zu behandeln. Darüber hinaus könnte die Kombination verschiedener Arten der Einzelzellanalytik, wie z.B. der Live-Cell-Imaging mit fluoreszierenden Biosensoren und der Einzelzelltranskription oder Genomik, um das molekulare Verhalten einer Zelle mit ihrem späteren Schicksal zu verknüpfen, eine wichtige Richtung für die Forschung zum Zellzyklus darstellen.

Fazit

Im Allgemeinen können Einzelzellstudien das Problem der Zellheterogenität angehen. Durch die Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung in Kombination mit Clusteranalysen und mimetischer Zeitanalysen können wir den kontinuierlichen Zellzyklusprozess rekonstruieren und somit den zellulären Mehrwertzustand ableiten; durch die Analyse spezifisch exprimierter Gene können wir bekannte und unbekannte Gene entdecken, die mit Zellteilung und Zellzyklus assoziiert sind; durch die Analyse der molekularen Informationen von Zellen können wir die Differenzierungs- und Entwicklungsfate von Zellen ableiten usw. Es kann gesagt werden, dass Einzelzell-Zyklusstudien ein wichtiges Anwendungspotenzial in der Regulierung von Entwicklungssignalen, der Reparatur von Krankheitsschäden, der Tumorimmunogenese usw. haben.

Referenzen:

1. Van den Berge, Koen, et al. "Trajektorienbasierte differenzielle Expressionsanalyse für Einzelzell-Sequenzierungsdaten." Naturkommunikationen 11.1 (2020): 1201.
2. Wang, Zhixiang. "Regulation des Zellzyklusfortschritts durch wachstumsfaktorinduzierte Zellsignalgebung." Zellen 10.12 (2021): 3327.